实验七 核酸的定量测定—定磷法.pptVIP

实验七 核酸的定量测定—定磷法 一,原理 生物体内有许多含磷化合物，如核酸（RNA,DNA）磷脂，ATP等。磷的测定方法很多，但在生化研究中以比色法的应用最为广泛，该法量微，快速，准确。 核酸和核苷酸均为含鳞化合物，纯的核酸喊磷量为9%（RNA含磷量为8.5%--9.0%,DNA则含9.2%的磷）。从核酸中测得了总磷量，就可知样品中核酸的量，即每测得1mg有机磷，就表示有11mg的核酸，这就是定磷法的理论依据 * * 在测定过程中，浓硫酸与核酸共热使其转变为无机磷（此为消化过程），而无机磷与定磷试剂中的钼酸铵在酸性条件下反应生成磷钼酸铵，它在还原剂作用下被还原成深蓝色的钼蓝（高价钼被还原成低价钼），钼蓝在660nm初有最大光吸收峰。在一定的磷浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比 生物有机磷材料中有时含有无机磷杂质，为了消除无机磷的影响，应同时测定样品中的总磷量和样品中的无机磷含量（样品未经消化而直接测定的含磷量）。从总磷量中减去无机磷量，才是样品中的真正磷含量。 核苷酸的消化和核酸一样。此外嘌呤类核苷酸可用1.5mol/L的HCL，100℃ 水解1小时脱磷；嘧啶类核苷酸可用10mol/L 消化1—2个小时脱磷。 二，试剂 1.标准磷试剂（含磷5μg/ml）:准确称取恒重（105℃ ）的 0.4389g,用水定容到100ml，此液的浓度为1mg/ml，用前再稀释200倍，即为5μg/ml。 2.定磷试剂： (1)6mol/L硫酸：取17ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加入83ml水中。 (2)2.5%钼酸铵：2.5g钼酸铵溶于100ml水中 (3)10%抗坏血酸溶液：取10g抗坏血酸溶于100ml水中。棕色瓶4 ℃ 贮藏。溶液应为淡黄色，深黄色或棕色则不能用。 3. 催化剂：硫酸铜（ ）：硫酸钾 （ ）=1：4（W/W）,研成细末。 4. 30%过氧化氢，浓硫酸 三，操作方法 1.制作磷标准曲线： 取标准磷酸溶液（ 5μg/ml ）0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml，用水补足到3ml，含磷量分别为0，2.5，5，7.5，10，12.5，15 μg，加定磷试剂3ml后摇匀，45 ℃放置20分钟，测 。以含磷量为横坐标， 为纵坐标制作标准曲线。 2. 核酸中总磷量的测定： 取1ml被测样品液（约含2.5—5mg核酸，也可取固体样品），置于消化瓶中，加入1ml浓硫酸及50mg催化剂，在消化炉上加热至发白烟，样品由黑变成淡黄色，取下稍冷，加数滴30%过氧化氢液，继续加热至 溶液呈无色可淡蓝色为止，稍冷却，加1ml水，于100 ℃加热10分钟使焦磷酸转变为磷酸。冷至室温，用蒸馏水定容到50ml。与样品消化的同时做空白对照，空白瓶中不加样品，用水替代，其它完全相同。 取稀释后的消化液1ml，加水2ml，定磷试剂3ml，摇匀，45 ℃放置20分钟，于660nm处读取OD值。空白对照同样操作。 3. 样品中无机磷含量测定： 取未消化的核酸样品液1ml用水定容到50ml。从中取1ml，加2ml水，3ml定磷试剂，摇匀后保温，然后读 *