急性移植物抗宿主病状态下骨髓血管niche缺陷及其对造血干%2f祖细胞的影响.pdf

忽性移植物抗宿主条件-F管niche的改变及对造血干／祖细胞的影响 摘 要 stemcells 异基因造血干细胞移植(allogeneichematopoietictransplantation； allo．HSCT)是目前用于治疗良、恶性血液病、联合免疫缺陷病和某些自身免疫性 疾病及一些实体肿瘤等疾病的重要手段。急性移植物抗宿主病(acute disease；aGVHD)是影响异基因造血干细胞移植成功最常见的 graft—versus．host 并发症，其病理生理机制为植入的供体免疫活性细胞(T淋巴细胞)被宿主(受 体)抗原致敏而激活、增殖、分化，直接或间接导致靶器官的损害。aGVHD往 往伴有造血功能障碍，影响患者生存。但目前aGVHD导致免疫造血功能障碍的 机制尚不清楚。其机制有两种可能：一是aGVHD过程中产牛的细胞因子导致造 血功能受抑，另一可能机制为骨髓微环境(niche)缺陷导致的HSC功能调控障 碍。近年来的研究表明疾病状态下骨髓niche对HSC有显著影响。目前研究认为 endothelialcells； 成骨细胞所组成，后者主要由血管窦状隙内皮细胞(sinusoidal 自我更新能力等方面发挥重要作用。allo．HSCT后受体造血细胞来源于供体造血 干细胞，而骨髓niche仍为受体来源，因此理论上受体骨髓niche，尤其是血管 其是血管niche功能缺陷，从而影响niche对供体正常HSC的功能调控，引起 HSC牛物功能改变和数量减少。因此研究急性GVHD是否通过导致骨髓血管 niche功能缺陷从而引起造血功能障碍和初步阐明其机制，具有重要的理论意义 和潜在的临床应用价值。 木研究拟解决以下几个丰要问题：1．如何鉴定小鼠骨髓窦内皮细胞?建立主 histocompatibilitycomplex；MHC)半相合小鼠骨髓 要组织相容性复合物(major 移植aGVHD模型，利用多参数设门，流式细胞术分选骨髓窦内皮细胞，并用细 胞化学染色等手段鉴定。2．aGVHD对骨髓窦内皮细胞的影响及其机制如何?采 用流式细胞术和骨髓组织病理学、RT．PCR方法检测aGVHD组及对照组(无 aGVHD)小鼠骨髓窦内皮细胞的数量、比例、增殖、凋亡及MHC分子表达及T 髓内皮细胞变化的相关性及机制?流式细胞术检测HSC的数量和比例；竞争性 及连续性移植模型检测aGVHD对HSC、骨髓微环境的影响；流式细胞术检测骨 (SCF／C．Kit轴)。 第二军医大学博士学位论丈 第一部分小鼠半相合aGVHD移植模型建立和骨髓窦内皮细胞 免疫表型及鉴定 研究方法 型CD45．2)；供体小鼠：雄性CB6F1(BALB／c H．26；表型CD45．1；F1 H一2洲；表型CD45．1／2)。随机分为三组：GVHD组每 只受体小鼠移植CB6F1来源的骨髓细胞5×106和髀细胞6×107，正常移植对照 组每只小鼠仪移植CB6F1来源的骨髓细胞5×106，空白对照组仅接受输注同体 积的PBS。半相合移植模型受体小鼠移植前接受8Gy同位素铯照射。观察移植 后急性GVHD发牛情况及小鼠生存、检测外周血。取移植后14、21天GVHD 及BMT组小鼠皮肤、肝脏、小肠行常规石蜡包埋病理切片，HE染色。流式细 胞检测造血细胞CD45．1、CD45．2表达了解植入情况。流式细胞术检测 CD150+／CD48．设门检测造血干细胞数量比例 骨髓窦内皮细胞免疫表型及鉴定流式细胞术检测正常小鼠骨髓单个核细胞 作为细胞化学染色对照。 结果 成功建立小鼠半相合移植急性移植物抗宿主病模型PBS组移植10天后出 现死亡，急性GVHD组小鼠10天后逐渐出现腹泻、血便、体重减轻、脱毛、 弓背等表现，15天后出现死亡，BMT组全部存活。急性GVHD的发病率为 100％；病理切片HE染色提示：可见皮肤、肝脏、小肠组织形态学改变及其中 不同程度炎性细胞浸润符合GVHD表现；流式细胞检测提示受鼠造血细胞表型 造血干细胞的数量比例减少提示该模型可出现造血抑制，能够满足研究的需要。 胞化学染色，阳性率95