槐耳浸膏干预肝癌增殖及转移实验与研究.pdf

槐耳浸膏干预肝癌增殖及转移的实验研究 中文摘要 肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。近年来其发病率有不断上升趋势。目前临床 上治疗肝癌的方法有多种，手术切除仍是最有效的治疗措施之一，但远期疗效有待进 一步提高。目前药物治疗存在的主要问题是：有效药物比较少，选择余地比较小，长 期应用某种药物不仅毒副作用大，且肿瘤极易产生耐药性。故寻找新的抗肿瘤增殖和 抗肿瘤转移复发的药物成为目前肿瘤治疗的热点。这新一代的抗肿瘤药物应该具有疗 效稳定可靠，可提高机体免疫力，毒副作用小，肿瘤不易对其产生耐药性等特点。中 药尤其是药用真菌因具备以上特点而倍受人们的关注。近年来槐耳颗粒在临床上的应 用已证明其对肝癌、肺癌、食管癌、胃癌等肿瘤有独特疗效。但其抗癌机制迄今为止 尚未见全面报道，尤其是在抗肝癌的转移和复发的基础研究方面所见报道极少。本研 究目的即试图通过槐耳浸膏干预肝癌细胞的黏附、运动、侵袭、凋亡以及在动物体内 的转移和基质金属蛋白酶的表达，较为系统地探讨槐耳浸膏抑制肝癌细胞增殖和转移 的机制，为临床治疗肝癌提供理论依据。 第一部分槐耳浸膏在体外干预肝癌细胞增殖和转移的研究 肿瘤细胞的转移离不开肿瘤细胞的黏附、运动、侵袭等环节，其中的任一环节被 打断均可导致肿瘤细胞转移能力的下降或消失。槐耳浸膏抑制肝癌细胞的转移是因主 瘤细胞增殖被抑制导致侵袭细胞数目减少，相应减少转移灶形成的几率，还是对瘤细 胞转移的以上几个环节的直接作用，目前尚不清楚。因此，我们在体外研究了槐耳浸 膏对肝癌细胞黏附、运动、侵袭以及凋亡的影响。 (一)槐耳浸骨对MHCC97H细胞黏附作用的影响 孵育3小时，去除未黏附的细胞，加入1％亚甲兰，用600nm波长检测黏附百分比。 耳浸膏作用后黏附能力明显下降。统计结果说明槐耳浸膏各浓度组与空白对照组相比 差异均有统计学意义(P0．01)，槐耳浸膏浓度与肿瘤细胞黏附率成负相关。说明槐耳 浸膏可通过干扰MHCC97H细胞的黏附作用来干预细胞转移的过程。 (二)槐耳浸膏对MHcC97H细胞趋化运动的影响 滤膜姬姆萨染色，计数穿膜细胞数。结果显示：MHCC97H细胞运动能力强，空白对 明显下降，显示出较强的运动抑制力。在槐耳浸膏组中，随着浓度的增加，MHCC97H 细胞穿膜细胞数逐渐减少，呈现出明显的剂量依赖性。统计结果说明各槐耳浸膏组与 空白对照组相比差异均有统计学意义(p0．01)。槐耳浸膏浓度与肿瘤细胞趋化运动抑 制率成正相关。 (三)槐耳浸膏对MHCC97H细胞侵袭能力的影响。 DMEM和槐耳浸膏(1 细胞预孵育24h，重新计数后加入预铺Matrigel 小时后，侵袭力下降，显示出较明显的侵袭抑制作用。在槐耳浸膏组中，随着浓度的 增加，MHCC97H细胞穿膜细胞数逐渐减少，呈现出明显的剂量依赖性。统计结果说 明各槐耳浸膏组与空白对照组相比差异均有统计学意义(po．01)。槐耳浸膏浓度与 MHCc97H细胞侵袭抑制率成正相关。 (四)槐耳浸膏诱导MHCC97H细胞凋亡的实验研究 buffer 专用管，加入Annexin-V-FITC5ul，PI 400ul。在lh内上机 5ul。再加入1×binding 检测细胞凋亡率。结果显示：不同浓度槐耳浸膏在每一时段上诱导肝癌细胞的凋亡率 明显高于对照组，两者差异有统计学意义(P0．01)。各槐耳浸膏组中凋亡率的升高有 明显的剂量相关性，且诱导肝癌细胞凋亡的作用随药物作用时|’日J的延长而增加。 第二部分槐耳浸膏在体内干预肝癌增殖及转移的实验研究 槐耳浸膏在体外有明显的诱导肝癌细胞凋亡，抑制肝癌细胞黏附、运动、侵袋的 作用。但在体内是否能抑制肝癌细胞的转移，目前尚未知。本实验通过槐耳浸膏干预 人肝癌高转移细胞瘤株在体内的转移以及基质金属蛋白酶的表达来探讨这一问题。 胃。对照组每天灌生理盐水。灌胃给药体积均为0．2ml／只，每天灌胃1次。饲养裸鼠4 周后处死裸鼠。测量两组裸鼠肿瘤的重量，观察两组裸鼠肿瘤的肺转移、腹腔淋巴结转 移及肝内播散灶的数目。测定两组裸鼠肿瘤组织中基质金属蛋白酶的浓度。方法：肿瘤 组织于解冻前切割，称量。加入预冷的匀浆液(每0