不同洗涤离心力对脐血间充质干细胞纯化及影响.pdfVIP

摘 要 Y2224522 目的：由于间充质干细胞(MSCs)对于人类疾病治疗具有潜在的、可 预期的重大影响，近年来，许多学者致力于应用MSCs治疗疾病的基 础与临床研究，其中，以脐血间充质干细胞(UCB—MSCs)的研究为主 导。目前，UCB-MSCs已被成功诱导分化为多种组织细胞，不少学者 也对UCB-MSCs的分离纯化技术进行了探索，对其培养方法、培养条 件进行了诸多的改良和优化，但在不同洗涤离心力对UCB-MSCs纯化 的影响方面却鲜见报道。笔者在进行UCB-MSCs培养时，反复使用大 RCF=3789)洗涤技术，始终未能获得满意的细胞贴壁及生长结果，分 析认为是由于该洗涤方法所得到的细胞纯度不高所致。由于不同离心 力洗涤对于干细胞纯化的影响举足轻重，故有必要对其进行深入的研 究。本实验在其它实验条件不变的基础上，首先将脐血离心并有效分 层，然后使用不同离心力洗涤，观察对比不同洗涤离心力对UCB-MSCs 纯化的影响，以期寻找出更有利于干细胞纯化的适宜洗涤离心技术， 集适应症的孕妇8名，无菌采集脐血约40ml。首先以1：1比例用0．9％ 生理盐水将脐血稀释，然后按照1：1比例将稀释后脐血缓缓加入淋巴 g)，将脐 血有效分层。轻轻吸取中间白膜层约30ml，添加0．9％生理盐水至50ml 1000 r／min离心10min(1689)、800 涤后均弃上清液，余细胞沉淀约0．5ml，加入L-DMEM一10％胎牛血清一 庆大霉素培养基至10ml，混匀后分别接种于T25培养瓶，倒置相差 显微镜下观察(放大倍数10×20)，选取混杂物质数量居中的视野， 对比每组混杂物质的差异并行图像采集，使用多项目自动血球分析装 UNCs率(％)，使用SPSSl5．0统计学软件进行统计学分析，并绘制曲 线图。另外，移液枪吸取每份细胞悬液一滴涂片，行瑞氏染色，于油 镜下观察杂质情况并采集图像。在细胞接种后第7天弃全部培养液， 倒置相差显微镜下观察，于各接种瓶中选取贴壁细胞数量居中的的视 野5个，分别计数后行方差分析，并观察对比梭状细胞数。细胞接种 后第14天，分别观察每瓶细胞生长情况，选取生长情况居中的视野 采集图像。结果：1、比较不同离心力洗涤后接种当时在倒置相差显 大量细胞外，可见大量混杂物质，而1200r／min洗涤、1000r／min 洗涤、800r／min洗涤接种瓶中除大量细胞外，混杂物质明显低于前 两者，800r／min洗涤接种瓶尤为显著，将细胞悬液涂片行瑞氏染色 后于油镜下观察(放大倍数10×1000)，结果同倒置相差显微镜下观 分析，其中MNCs密度(109／L)随洗涤离心力降低有降低的趋势、MNCs 率(％)随洗涤离心力降低有升高的趋势，但二者的差别均不具有统 离心力降低有降低的趋势， 其数据差异具有统计学意义(PO．05)。 3、细胞接种后第7天，于各接种瓶中选取贴壁细胞数量居中的的视 野5个，分别计数后行方差分析，其差异具有统计学意义(PO．05)， 观察对比梭状细胞数，800r／min洗涤的各接种瓶中，梭状细胞数／5 个／视野的约有5-8个视野，1200r／min洗涤、1000r／min洗涤的各 中无满足条件的视野。4、接种14天后倒置相差显微镜下观察， 800r／min洗涤的接种瓶中细胞生长情况相对最佳，2—5个视野下可见 梭状细胞融合抱团生长(抱团细胞数≥7个／视野)，其余接种瓶从未 见抱团生长情况，且细胞趋于死亡。结论：1．在使用淋巴细胞分离 涤法所获得的细胞纯度不高，其中含大量混杂物质，不利于UCB—MSCs 贴壁、生长和分化，低离心力洗涤可使UCB-MSCs纯度大大提高，利 2、在使用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心法分离提纯UCB-MSCs 影响，PLT残余量可能才是影响UCB—MSCs贴壁的最主要因素，在洗 涤细胞时应着力去除。 关键词：脐血间充质干细胞纯化离心力 for TheInfluenceofVarious Force Washing Centrifugal UmbilicalCord