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全面的质粒抽提纯化疑难解答 来源：生兴生物 质粒抽提该实验成功的标志是去除RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，得到相对纯净的质粒。 图：质粒大量抽提 1.常用试剂1）溶液I：EDTA：螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时一定的金属离子作辅基）。有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。 （2）溶液II: 新鲜NaOH /SDS。新鲜III：醋酸钾（KAc）缓冲液KAc：用pH4.8的KAc溶液是为了把pH12.6的抽取液pH调回到中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol∕L KAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷。减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白质复合物作用后，能形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀完全。 （4）苯酚/氯仿/异戊醇：沉淀蛋白质。酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。异戊醇其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。 （5）乙醇：沉淀质粒DNA。此为实验中最常用的沉淀方法。DNA溶液时以水合状态稳定存在的DNA，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。使用乙醇在低温条件下沉淀DNA，分子运动大大减少，DNA易于聚合而沉淀，且温度越低，DNA沉淀得越快。 （6）氯霉素：大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。而在细菌繁殖的对数生长期中期加入氯霉素还可以增加质粒DNA的拷贝数，也可以抑制在需要大量制备质粒时，细菌增长过多，便于质粒的抽提。 2.纯化方法 常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状这样两个性质。 例如，用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和（每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子）。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。一些大肠杆菌菌株（如HB101的一些变种衍生株） 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。故从诸如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法 多年来，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。 3.疑难问题解答 Q：质粒DNA不能被限制酶所切割？ A：A：A：因为既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性；又要使染色体DNA不断裂成小片段而能与质粒DNA相分离。这就要求试剂与溶菌液充分摇匀，不可过分用力。 Q：加入溶液I蜗旋振荡时，发现菌体呈絮状不易混匀，或成细砂样。 A：很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间、降低培养温度，通常降低培养温度会使细菌生长更加稳定。同时也要注意是否有其他菌污染。 Q：加入溶液II，菌液浑浊度没有发生明显变化。 A：裂解不完全，主要问题是发生在溶液II上。确保10％SDS是澄清的，确认NaOH是有效的。 Q：手工提取质粒，使用PEG8000纯化的问题。 A： 分子生物学使用级别PEG8000不需要灭菌。加入PEG8000前，质粒应该溶解在TE中，而不是含有大量其它杂盐得溶液。用PEG8000纯化前，质粒溶液经过乙醇或异丙醇沉淀，且经过70％乙醇漂洗过的。沉淀步骤在冰上或4度进行。PEG8000的沉淀是透明的，有时可以看到沉淀，而有时很难辨出沉淀，但后续酚仿抽提时会在水相和有机相间出现大量白色沉淀层。 Q：没有提出质粒或者质粒