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第1单元 基因工程 记忆网络图解 1.1 DNA重组技术的基本工具 核心考点背记 1.1.1 基因工程的概念 基因工程的别名 基因拼接技术或DNA重组技术 操作环境 生物体外 操作对象 基因 操作水平 DNA分子水平 基本过程 剪切→拼接→导入→表达 结果 人类需要的基因产物 1.1.2 限制性核酸内切酶一一“分子手术刀” （1）存在：主要存在于原核生物中。 （2）特性：一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。 （3）识别的序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中心轴线两侧的双链八上的碱基是反向对称重复排列的。 如：以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，两侧碱基互补对称。 （4）切割后末端的种类：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端（如图所示）。当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。 切割分子时产生的两种不同末端(箭头表示酶的切割位置） 特别提示 ①限制性核酸内切酶是一类酶而不是一种酶。 ②限制性核酸内切酵作用的化学键为磷酸二酯键，而不是氢键。 ③不同种类的限制性核酸内切酶识别与切割的位点不同。这与酶的专一性是一致的。 1.1.3 DNA连接酶——分子缝合针 种类 E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能特性 只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来 缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低 相同点 都缝合碳酸二酯键,如图: 1.1.4 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）载体具备的条件 ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 （3）其他载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。 综合 限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶与解旋酶 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶 作用底物 DNA分子 DNA分子 片段 脱氧核苷酸 DNA分子 作用部位 磷酸二 酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 碱基对间的氢键 作用结果 形成黏性末端或平末端 形成重组 DNA分子 形成新的 DNA分子 形成单链 DNA分子 1.2 基因工程的基本操作程序 核心考点背记 1.2.1 基因工程的基本操作流程 1.2.2 目的基因的获取 （1）从基因文库（基因组文库或cDNA文库） 基因组文库 文库大小 小 大 基因中启动子 无 有 基因中内含子 无 有 基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 物种之间的基因交流 可以 部分基因可以 说明 基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作霣大，具有一定的盲目性 （2）人工合成目的基因：常用的方法有化学合成法和反转录法。 化学合成法：蛋白质氨基酸序列RNA碱基序列DNA碱基序列用4种脱氧核苷酸人工合成目的基因 反转录法：分离出供体细胞mRNA单链DNA合成目的基因 （3）利用PCR技术扩增目的基因：通过PCR（多聚酶链式反应）可对已获取的目的基因进行扩增，在短时间内获取大量目的基因。 PCR技术 DNA复制 过程 DNA变性(90～95℃)→退火(复性55～60℃)→子链延伸(70～75℃)重复循环 DNA复制起始，DNA引物生成→DNA片段生成→RNA引物水解→完整的DNA分子形成 相同 点 原则 碱基互补配对 条件 模板、原料(dCTP、dATP、dGTP、dTTP)、能量、酶、引物等 不 同 点 解旋 方式 氢键在高温下断裂、双链全部解开 解旋酶催化氢键逐步断裂 场所 体外 主要在细胞核中 引物 DNA RNA 酶 热稳定DNA从聚合酶 (Taq酶) 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等 结果 在短时间内形成大量的DNA片断 形成完整的DNA分子 1.2.3 基因表达载体的构建一基因工程的核心 （1）基本过程: ①用同一种限制酶分别切割载体与含目的基因的DNA分子，产生互补的黏性末端或平末端。 ②用DNA连接酶将载体与目的基因“缝合”起来，形成重组DNA(基因表达载体)。 ③将重组DNA导入受体细胞进行增殖和筛选。 （2）表达载体的组成：目的基因十启动子十终止子十标记基因。 ①启动子：一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。它是与RNA聚合酶结合的部位