孙泽权那组的实验方案.docVIP

材料与仪器 （1）材料及试剂 海鞘：采自饶平海边，并养殖于实验室水族箱中 磷脂酶A2(Lecitase 10L):NOVO公司； 蛋白酶: 537酸性蛋白酶、1398中性蛋白酶、HAP碱性蛋白酶:无锡星达生物工程有限公司生；木瓜蛋白酶广州远天酶制剂厂;Alcalase（碱性内切蛋白酶）、Flavourzyme（风味酶）:Nova Nordisk公司生产； DNase I（DNA酶） （2）仪器 721型分光光度计、酸度计、恒温水浴锅、 方法 采集→培养→解剖→物理化学方法处理→酶处理→性质检测 3、实验步骤 （1）解剖了解其结构 （2）取其体壁（主要是动物性纤维，切成大小、厚度适中的块状） ①用剪刀从海鞘体壁上剪取大小1cm2的小块并用手术刀刮掉海鞘体壁上脂肪、肌肉之类的结缔组织（注意不要刮破体壁）（或许可以微加热，使一些蛋白质变性更容易刮除） ② （3）酶处理（用三种酶轮流处理去掉上面的脂肪、细胞，最后只剩下一层动物性纤维，酶的用量、浓度、时间、温度一般为37℃等等，实验前要先预热）（pH和温度看酶产品上有没有提供，如果没有再加两步实验） ①用磷脂酶A2处理海鞘体壁（酶的最佳温度50℃、pH=9值等参数应该在酶产品上有给出） 1)确定最佳酶液浓度 酶解前加入适量的CaCI2:使钙离子浓度为150mM。以温度50℃，pH9. 0，钙离子浓度150mM为反应体系，改变磷脂酶A2量为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％,酶解4小时后分析酶解磷脂的量 酶解磷脂的分析： 酶解磷脂含量的测定采用反胶团酚红比色法。取酶解反应液50%μL注人到5 ml反胶团酚红测定液中振荡至透明，在560nm下测出酚红反应液与酚红测定液之间的吸光度差值(X),酶解磷脂的生成量(Y)为:Y = 15. 973X一0. 018 mmol /L。 2)确定最佳反应时间 以温度50℃，pH9.0，钙离子浓度150mM为反应体系，从1~6小时设定6个不同酶解时间进行实验，之后分析酶解磷脂的量 ②用酸性蛋白酶处理海鞘体壁（用分光光度计测定） 1)选择最佳蛋白酶 试验中，选用537酸性蛋白酶、1398中性蛋白酶、HAP碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、Alcalase(碱性内切蛋白酶)、Flavourzyme(风味酶)等6种蛋白酶，在其各自的适宜反应条件下对海鞘体壁进行水解研究。最后过滤水解液做吸光度的研究。 2)确定最佳酶液浓度 用最佳蛋白酶在酶量为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％,酶解4小时后测吸光度 3)确定最佳酶解时间 在适合的体系下从1~6小时设定6个不同酶解时间进行实验，之后测吸光度 ③用DNase I（最适pH：在pH7.0附近，在pH5～6区域稳定。辅因子：Ca2+ 活化剂：Mg2+