重组门冬酰胺酶II的表达及制备.docVIP

重组天冬酰胺酶II研究进展 摘 要 L-天冬酰胺酶Ⅱ因能够水解L-天冬酰胺而具有抗肿瘤活性，在急性淋巴母细胞白血病的治疗方面应用甚广。目前，利用重组DNA技术产生的重组菌表达产生的L-天冬酰胺酶Ⅱ是临床应用的一个重要来源，本文主要对这类重组菌的构建、表达研究及后续产物的分离纯化进行综述。 关键词 L-天冬酰胺酶Ⅱ；大肠杆菌；基因工程；分离纯化 Ⅰ引言 L-天冬酰胺酶（Asparaginase，门冬酰胺酶或天冬酰胺酶；EC3.5.1.1）用于急性淋巴母细胞性白血病的治疗已有30年了[1]。L-天冬酰胺酶可催化L-天冬酰胺（L-Asn）水解成L-天冬氨酸（L-Asp）和氨（NH3），此外它还能催化L-谷氨酰胺发生类似反应[2]。由于某些肿瘤细胞缺乏L-天门冬酰胺合成酶（正常人体细胞含有该酶），而细胞存活需要外源天冬酰胺的补充，L-天冬酰胺酶对天冬酰胺的降解作用恰好切断了门冬酰胺的血源性供给，肿瘤细胞由于缺乏该氨基酸不能进行蛋白质合成而死亡[1,3]。 目前，L-天冬酰胺酶分为I型和II型，尤其是II型，因其具有肿瘤抑制活性而被广泛研究[2]（下文如无特别说明，天冬酰胺酶即指L-天冬酰胺酶II）。天冬酰胺酶的谷氨酰胺水解活性给其临床应用带来了严重的副反应，因此筛选低谷氨酰胺酶活性的天冬酰胺酶是研究重点之一[2]。本文主要就L-天冬酰胺酶II的表达与制备进展进行综述。 Ⅱ工程菌的构建，发酵和分离纯化研究 1961年豚鼠血清中的抗肿瘤因子被证实为L-天冬酰胺酶[4]，随后科学家们又在大肠杆菌中发现了具有抗肿瘤活性的天冬酰胺酶，之后该酶又陆续在产气杆菌，芽孢杆菌，欧文氏菌，变形杆菌，链霉菌，曲霉，酵母等等微生物中被发现[5]。目前，临床使用的L-天冬酰胺酶主要从大肠杆菌，菊欧文菌和胡萝卜软腐欧文菌菌株中分离得到，这些来源的天冬酰胺酶其肿瘤抑制作用机制相同，差别主要在于药代动力学性质[1]。 尽管有很多菌株能产生天冬酰胺酶，国内外也已经构建了多株天冬氨酸酶高效表达的基因工程菌[6]，但是其中以大肠杆菌的研究最为充分[7]，接下来本文主要围绕表达天冬酰胺酶的大肠杆菌的研究进行展开。 表达菌株的构建 1995年，为了填补国内空白，刘景晶[8,9,10]等率先进行工程菌E.coli天冬酰胺酶ansB基因的克隆和表达研究，并首次在国内成功构建了天冬酰胺酶高效表达的基因工程菌pKA/CPU210009；随后他们又在中试过程中优化了工程菌的培养条件和发酵工艺，确定了重组天冬酰胺酶的提纯路线，并进行了产品鉴定。以上研究结果表明，工程菌发酵单位比野生菌高出100倍以上[9]，产品质量与天然品从基因序列、蛋白质一级结构到蛋白质物理化学性质等方面均一致，两者具有同质性[8]。 下面，以此为例，简单叙述工程菌的构建及筛选过程[9]： 首先从CPU210009菌株中提取DNA，并用PCR法扩增AnsB基因；随后将PCR扩增得到的AnsB基因DNA用Ncol和HindⅢ消化后，定向插入pKK233-2的多克隆位点而得到重组质粒；用重组质粒转化多个宿主菌，并用奈氏试剂筛选相应的阳性转化子CTA1～5，其中以CPU210009作为宿主菌的转化子（CTA5）的产酶能力显著高于其他转化子。 在宿主菌很多的情况下，如何快速准确的筛选阳性转化子对于提高实验效率很重要，本实验中采用的奈氏试剂即奈斯勒试剂显色法，此法快速、简单，可直接从培养培养皿中筛选出产天冬酰胺酶的菌株，并且可借助比色法进行定量测定，从而直接筛选出高表达菌株[11]。 其他工程菌的构建方法基本类似，主要差异在于天冬酰胺酶基因来源和表达载体的选择上。如Priscila Lamb Wink[1]和Gustavo Roth[2]等将胡萝卜软腐欧文(氏)菌中的天冬酰胺酶基因和pET30a(+)表达载体构建成重组体，并用于转化多株大肠杆菌，结果表明[2]所有测试菌株的天冬酰胺酶表达的最适温度为37℃，此研究对于生物反应器的放大实验过程及天冬酰胺酶的大量生产有重要意义。再如，张志红[6]等通过PCR反应扩增大肠杆菌JM109天冬酰胺酶基因(ansB)，将扩增片段与pMD18-T载体连接，构建成的重组质粒pMD18-T-asp再与与质粒pET-22b进行双酶切后，进行连接重组，之后转化感受态细胞，筛选重组表达载体pET-22b-asp。利用重组表达载体pET-22b-asp转化BL21(DE3)大肠杆菌，并对其发酵条件以及分离、纯化工艺进行了初步研究，结果表明工程菌成功进行了天冬酰胺酶的胞外表达并大大简化了后续分离步骤。 另外，科研人员还进行了一些特殊的产天冬酰胺酶工程菌的构建，如抗胰蛋白酶的天冬酰胺酶的研究表明，通过采用多克隆抗体、单克隆抗体或单链抗体稳定天冬酰胺酶，利用抗体有效抑制蛋白酶对天冬酰胺酶的水解作用，使其在体内