医学基因工程及应用.pptVIP

欢迎同学们听课！ 欢迎研究生听课！ 本课程内容 第一章 绪论 第二章 基因克隆的工具酶 第三章 基因工程的载体 第四章 目的基因的制备 第五章 目的基因导入和重组子的筛选 第六章 外源基因的表达 第七章 基因操作的基本技术 第八章 植物基因工程及应用 第九章 动物基因工程及应用 第十章 医学基因工程及应用 第十章 医学基因工程及应用 第一节 重组医学的生产 第二节 鉴定疾病相关基因 第三节 基因治疗 第一节 重组医学的生产 一、重组的胰岛素　　胰岛素是由胰腺中的胰岛中的β细胞合成的，可以控制血液中的血糖水平。人体中缺乏胰岛素可以导致糖尿病，注射胰岛素可以控制这一疾病。最初是从牛或猪的胰脏中提取的，部分病人可以使用，但某些病人可能有副作用，另一个问题是纯化是比较困难的，某些有毒物质很难完全除去。　　胰岛素具有两个特性使其能够利用基因克隆技术进行生产。 (1) 胰岛素这种人体蛋白在翻译糖化后不再进行修饰，通过细菌合成的重组胰岛素是有活性的。 (2) 分子量。胰岛素是相对较小的蛋白质，含有两个多肽，A链有21个氨基酸，B链有30个氨基酸。在人体中首先合成的是前胰岛素原，A链和B链通过C链相连，前端还有一段前导序列。翻译后，C链和前导序列被切除，A链和B链通过两个二硫键相连。　　a) 合成和表达人工胰岛素基因　　1978年合成了A链和B链的基因。人工合成的基因不一定与人体内的基因序列相同，但对应的氨基酸序列必须正确。　　随后构建了两个重组的质粒，一个编码A链，另一个编码B链，每一个质粒中，人工基因都被插入到pBR322类的质粒的lacZ’读码框内。胰岛素基因就在 lac启动子的控制之下进行合成，产生了的多肽含有β-半乳糖苷酶的最初几个氨基酸。两者之间的连接处是一个蛋氨酸残基，可以利用cyanogen bromide溴化氢从此处切开。最后将两条链用二硫键连接起来。效率很低。　　b) 将整个地读码框B-C-A构建载体，这样就可以高效的形成二硫键。利用蛋白水解酶很容易将C链切下。 胰岛素表达载体的构建 二、在E. coli中合成人生长激素　　就在利用E. coli合成人工胰岛素的同时，另一项相似的工作也在进行中，人的生长激素：生长激素和生长激素抑制素，这两种蛋白结合起来控制人的生长，两种激素失衡可以导致巨人症和侏儒症。　　生长激素抑制素是第一个在E. coli中合成的人类蛋白，它是一个很小的蛋白，仅有14个氨基酸，非常适合于人工合成，它与胰岛素的合成方法相似。 生长素抑制素的合成 生长激素的合成就存在一些问题，这种蛋白有191个氨基酸，大约有600bp。利用人工合成与cDNA克隆相结合的方法构建的载体。mRNA是在垂体中获得的，人体中合成生长激素的部位，构建了cDNA文库。在生长激素的cDNA中有HaeIII的单一切点，可以将基因切成两部分，较长的片断，从第24个氨基酸到第191个氨基酸，被用来构建载体，较短的片段利用人工合成的片段代替以提供能在E. coli中翻译的信号。经过修饰的基因连接到含有lac启动子的表达载体中。 生长素的合成过程(一) 生长素的合成过程(二) 三、重组因子VIII 血友病的最普遍的形式是不能合成VIII因子，破坏了血液的正常的凝固。目前治疗血友病的唯一途径是注射纯化的VIII因子蛋白，从血液中可以提取VIII因子蛋白，但VIII因子的纯化是非常复杂的，也是非常昂贵的，治疗一位患者每年大约需要10000$。而且血液中的病毒颗粒很难去除。肝炎和AIDS可以通过注射VIII因子传染给血友病患者。VIII因子重组蛋白，可以避免病毒的感染。　　VIII因子基因是非常大的，超过186kb，含有26个外元和25个内元。其mRNA编码2351个氨基酸的多肽，而且要经过复杂的加工过程，最后产生一个来自于上游的大亚基和来自于下游的小亚基的二聚体。这两个亚基含有17个二硫键和大量的糖基化位点， 如此大而复杂的蛋白质，E. coli根本无法合成有活性的分子。　　大部分获得VIII因子蛋白的尝试使用哺乳动物的细胞。最初的试验使用全长的cDNA，利用大颊鼠（东欧或亚洲产）作为寄主，但蛋白质的产量非常低。这可能是因为翻译后的加工过程，不能将所有的初产物转化为有活性的形式，因而限制了整体的产量。然后又使用分离的两个cDNA片段，一个片段编码大亚基，另一片段编码小亚基，每一段cDNA都被连接表达载体，以Ag启动子引导（是鸡的β-actin 肌动蛋白和兔β-globin球蛋白的杂交序列），下游连接来自SV40病毒的多腺苷酸化信号。这样的重组质粒被引入大颊鼠的细胞系中获得重组蛋白，产量提高了10倍多，而且仍然具有活性。 重组因子VIII的复杂结构 四、重组疫苗 　　 疫苗是一种抗原，注入血液后刺激免疫系统合