质粒DNA的提取与检测.docVIP

质粒DNA 的提取与检测 1 概述 细菌质粒是一些双链、闭环的DNA分子，其大小范围从1kb至2000kb不等。已经存在形形色色的细菌类群中发现质粒，这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的遗传单位。然而，它们又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。通常，质粒含有编码某些酶的基因，这些酶事实上在一定的环境下可能对细菌宿主有利。由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性、产抗生素、降解复杂有机化合物以及产生大肠杆菌素、肠毒素及限制酶与修饰酶等。 质粒DNA的复制由负责复制细菌染色体的多种酶来完成，但是不同的质粒在宿主体内所采用的酶迥然不同，而且在宿主中复制的程度也相差悬殊。一些质粒的拷贝数可高达700个／细胞，而另一些则只能维持在每套宿主细胞染色体仅对应l个质粒分子的最低水平上。控制质粒拷贝数的基因处于包括DNA 复制起点在内的一个质粒DNA 区域内。通常情况下，一个质粒只含有一个复制起始区（复制子）。 目前使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒的复制子。在正常生长条件下，每个细菌细胞中可维持至少15～20个拷贝（带有该复制子的质粒）。一般认为，这种多拷贝的质粒是以松弛方式进行复制的。pMB1 复制子的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半寿期较长的酶。因此，即使蛋白质合成并非正在进行，复制依然能够进行。这样，当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素存在时，带有pMB1复制子的质粒将继续复制，最后每个细胞中可以积聚两三千个拷贝。 单向复制从DNA 复制起点开始，由一个RNA 引物所引导，该引物的启动子位于复制起点上游大约550bp处。新生的RNA与DNA模板形成稳定的杂交体，作为RNA 酶H 的底物，由RNA 酶H 切割从而产生引导DNA 合成的引物。而RNAⅡ的成熟则由另一个不翻译的RNA小分子（RNA I）所控制。RNA I编码RNAⅡ的同一区段的DNA 的互补链转录而来，它可与RNA Ⅱ结合，并阻止RNA Ⅱ折叠为三叶草结构，而三叶草结构对于形成稳定的DNA-RNA 杂交体又是必不可少的。一个只有63个氨基酸的小蛋白（Rop蛋白）可以增强RNA I和RNA Ⅱ的结合，这一蛋白由位于复制起点下游400个核苷酸处的基因所编码。Rop 蛋白强化了RNA I对复制的负调节作用（图）。 图 带pMB1 （或ColE1）复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录物的方向及其粗略大小 因此，可削弱RNA I 和RNA Ⅱ之间相互作用的突变，将会增加带有pMB1 复制子的载体的拷贝数。。这些突变位于rop基因区或编码RNA I 和RNA Ⅱ的复制起点上游区内。例如,pUC质粒之所以拷贝数较高，是因为在RNA I的正常起始位点上游1 个核苷酸的位置带有G-A突变，结果RNA I转录物的起始位点位于正常起始位点下游3个核苷酸的位置。RNA I 5’-端的完整对于RNA I和RNA Ⅱ间的相互作用至关重要。因此，pUC 质粒拷贝数的增加看起来很可能是由缩短的RNA I和RNA Ⅱ结合效率降低所致。 除了控制拷贝数以外，质粒上编码RNA I、RNA Ⅱ和Rop蛋白的区段也决定两个不同的质粒是否可以在同一个细菌细胞中共存。利用同一复制系统的不同质粒不能稳定地和平共处，可以称之为不相容质粒。当两个上述质粒被导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中会彼此竞争。由于质粒是从细胞内的质粒库中随机选取出来进行复制的，所以两个不同的质粒在一个单细胞中的拷贝数并不是总能保持相同。最初在随机过程中产生的微小差异，将很快导致两种质粒在拷贝数上更严重的失衡。在一些细胞中，一种质粒处于优势；而在另一些细胞中，与之不相容的另一种质粒却占尽上风。细菌生长几代后，占少数的质粒将会丧失殆尽，在原始细胞的后代中可能含有两种质粒的任意一种，但不会兼而有之。 在分子克隆的所有操作中最基本的或许要算核酸的分离纯化，分离纯化核酸总的原则是：① 应保证核酸的一级结构完整性；② 排除其他分子的污染。为了保证对核酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求，因为遗传信息全部贮存在一级结构中。核酸的一级结构还决定其高级结构的形式及其和其他大分子结构结合的方式。 核酸的纯化方式应符合以下三个条件：① 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；② 其他生物大分子（如蛋白质、多糖和脂类分子）的污染应降低到最低程度；③ 排除其他核酸分子的污染，如提取DNA 分子时，应去除RNA 分子，反之亦然。 为了保证分离核酸的完整性和纯度，在实验过程中，应注意以下事宜。① 尽量简化操作步骤、缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。② 减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4～10