环境样品中DNA的分离化和纯化(林存刚).ppt

 环境样品中DNA的分离 纯化和文库构建 制作：林存刚 专业：微生物 学号：2003028 基因文库 gene library：将一个基因组的DNA用限制酶切割成适当大小的片段，并进行克隆化，包括其中每一种片段的汇总，称为基因文库。为防止用一种限制酶可能切断某个基因，应该用不同限制酶切割建立基因文库。对于一个大的基因组，通常这种基因文库是由霰弹法克隆构建的。根据基因文库的组成，可分为基因组文库和cDNA文库等。基因文库可用于研究基因的结构功能和筛选基因工程的目的基因。 分离纯化和文库构建 从分子水平上研究微生物的意义 分离纯化 文库构建 研究进展 从分子水平上研究微生物的意义 传统微生物学发展 微生物资源开发利用 现代生物技术发展 BACK 分 离 纯 化 样品采集和材料准备 分离和纯化 DNA浓度测定 BACK 浓度测定 粗制DNA浓度测定： 已知DNA的酶切产物与待测DNA一起进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，比较荧光亮度，推测DNA的浓度。 纯化DNA的浓度测定： 利用DyNA Quant 200 荧光仪测定。 返回 ? ? ? ? 文库构建和分析 理论基础 实施方法 评估分析 文 库 构 建 EcoRI酶切位点富含A/T(或PstI的酶切位点富含G/C），可以用来酶切建库。 载体和酶切片段都用同一种酶酶切后，才会具有互补位点，才能连接。 噬菌体菌落更容易保存。 实 施 方 法 EcoRI或PstI对纯化DNA进行酶切 琼脂糖电泳分离酶切产物 DEAE纤维素滤纸回收3~8kbEcoRI或PstI酶切段 载体处理（经EcoRI或PstI酶切和去磷酸化处理） 连接 连接产物转化大肠杆菌（病毒转染或氯化钙法） 蓝白斑筛选重组子 培养保存 返回 评 估 分 析 对阳性克隆插入片段进行单向测序 去载体部分处理 开放阅读框预测 BLAST同源性检索分析 推测开放阅读框可能编码的功能 BACK 开放阅读框 开放阅读框（ORF,open reading frame）是一个没有终止编码的密码子序列。在原核基因中，编码区是一个单独的ORF；而真核基因的编码区通常包含几个不相连的ORF（被非编码序列即内含子所分隔）。每条双链DNA有6个潜在的读框（reading frames）或称相位（phase）：一条链沿5’-3’方向有