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用生物技术改进万代兰增殖的方法 摘要：目前已经确立了多倍体细胞胚胎发生和由万代兰的愈伤组织获得再生植株的研究。体细胞胚胎发生的愈伤组织来源于根尖，茎和叶子的切片诱导，在填充有噻苯隆(Fay 1988年).。有报道，使用过组织培养技术成功的增加了兰花的种类（Seeni 和Latha 1992）。大批量繁殖筛选优良基因的需求刺激了组织培养技术的发展。本项研究旨在通过万代兰的体细胞胚胎发生方法，用愈伤组织培养，发展有效的植株再生方法。这也是目标部位的再生方法，主要应用材料为万代兰的茎、根和叶子。 材料和方法 长度为5mm茎节间，3-5cm叶子和5cm根尖用作愈伤组织的诱导培养。诱导材料放置在MS基础培养基表面（1962），培养基填充肌醇（100mg/l），维生素B6，HCl（0.5），盐酸硫胺（0.1），甘氨酸（2.0），蛋白胨（1000），Na2HPO4（170），椰奶（椰子汁，10%），蔗糖30000。在高压蒸汽灭菌15min，温度121℃，在灭菌之前，培养基的PH值使用1N KOH或者HCl调节到5.2。诱导材料分为两份，培养种植在培养管中跟踪观察一个月的生长。 在开始的两个月，用初始培养基进行愈伤组织水平的培养，然后在此培养条件下置入上述所提到的培养基进行接下来的培养。电镜扫描时取出固定的5%染色部位。 结果与讨论 初代和次代胚胎发生愈伤组织 目标片段的初步试验发现在1/2MS基础培养基中使用噻唑和2，4-D处理显示只有根尖形成了愈伤组织。因此，只有包含有分生组织的根尖片段被用于根移植培养以形成愈伤诱导。移植后4—5星期之间，培养的根段根尖（图1）。图1b茎段剖面展示了胚胎形成愈伤组织。来至于叶子（长度5-7cm）的移植段未形成任何可见的愈伤组织。表1展示了涉及了各种移植培养和生长调节剂处理的愈伤诱导频率。愈伤诱导最高的频率和最好的生长发生在根移植培养。3mg/l TDZ和3或者10mg/l2,4-D的组合有利于根尖的愈伤形成，同时茎移植培养的愈伤组织需要较少剂量的TDZ和2,4D。TDZ的效果，排序了0.3—3mg/l，5cm长度的幼叶愈伤组织的形成需要一个更高剂量（10mg/l）的2,4-D。 表1：2,4D和TDZ处理对万代兰叶、茎、根诱导愈伤组织 图1：愈伤组织。（一）：根，（b）：茎（三）：叶 胚形成 光照下，在转移到无激素培养基3-4星期后，愈伤组织变绿，在愈伤组织表面形成了体外胚胎细胞。胚胎的形成强烈的受到愈伤组织来源的影响。通常根得到的愈伤组织形成胚胎的频率要高于茎和叶得到的愈伤组织（Jen et al.2000）。然而这个实验茎得到的愈伤组织形成胚胎的频率要高于根和叶得到的愈伤组织（表2）。发现同源愈伤组织体细胞胚胎发生的程度不同。体细胞胚胎发生最高频率（90%）和平均5.9胚胎每愈伤组织是在填充有0.1mg/lNAA和3mg/lTDZ基础培养基上的茎得到的愈伤组织发现的（表2）。同时体细胞胚胎发生最高频率和胚胎平均数每愈伤组织是23.8%，平均10.6胚胎每愈伤组织是在填充有0.1mg/lNAA和0.3mg/lTDZ基础培养基的茎得到的愈伤组织。扫描电子显微镜观察胚胎形成。 体外胚胎细胞从愈伤组织的外部细胞层显露出来，显然开始形成单个细胞。 胚胎形成的能力受到愈伤组织来源的强烈影响。通常茎尖得到的愈伤组织形成胚胎的能力要高于叶和根得到的愈伤组织。这种高再生能力或许应该归于愈伤组织来源于茎生根尖的分生组织细胞。同样发现在同源愈伤组织细胞之间的体细胞胚胎发生的不同能力。 表二：NAA和TDZ处理的影响 植株再生 6个星期后，胚胎诱导培养在相同的基质上进行，绝大部分的胚胎继续扩增和在有预先设置的突出物的PLBs中发芽，众多的吸水力在后部区域（图2）。所有的植株高度5-8cm有6个叶和3个根的再生株在温室中栽种在填充泥炭藓的盆里。这些植株生长的都很好，存活率几乎达到90%。 图2：植株再生。（一）胚胎集群（二）初级胚胎（三）有根胚胎（四）苗 结论 这是第一次成功的尝试去通过建立愈伤组织获得体细胞胚胎的方法。形成愈伤组织的诱导材料来源于万代兰的茎，根和叶。这一研究展示了来源于万代兰根，茎，叶的片段得到的胚胎愈伤组织能够在无激素的MS培养基中形成体外胚胎。从愈伤组织开始到小植株（胚芽）的形成，这一过程需要大约一年。从愈伤组织形成胚胎对于兰科植物的体外活体培养十分重要。这一方法同样预示了使用生物技术方法改进其余兰科植物增殖的前景。