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中药及其优化培养基对双歧杆菌增殖的影响 摘要:采用比浊法确定枸杞和山药浸提物对青春双歧杆菌生长具有显著的促进作用.通过正交实验选择了该菌的两种增值培养基,其中50%枸杞浸提物的添加量为2%,25%山药浸提物的添加量为3%.对处于最佳培养基条件下,对该菌生长曲线进行了测定,稳定期时采用Hungate厌氧滚管技术计数,最高活菌数达到2.21@108cfu/mL. 关键词:青春双歧杆菌;中药;增殖;培养基优化 双歧杆菌(Bifidobacteria)是人体内不产生内外毒素的优势益生菌之一.1899年法国巴斯德研究院 Tissier博士,首次从健康母乳喂养的婴儿大便中分离到了该菌.自那以后,经过科学工作者多年不懈地研 究,认识到该菌具有营养、抗肿瘤、延缓衰老、维持肠道菌群平衡、抑制内毒素产生、增强人体免疫力等多重 功效[1,2].近年来,国内外出现了许多含双歧杆菌和其他益生菌的活菌制剂,有药品、保健饮品和乳制品 等.这些活菌制剂中的活菌数及其存活期是产品质量的关键所在.根据5卫生部关于印发真菌类和益生菌 类保健食品评审规定的通知(卫法监发〔2001〕84号)6,活菌类益生菌保健食品在其保存期内活菌数目不 得少于106cfu/mL. 双歧杆菌是严格厌氧菌,培养条件苛刻,生长十分缓慢.如何促进双歧杆菌增殖一直是研究的热点.我 们选用几种富含营养成分的天然中药(均是卫生部公布为药食同源的中药),通过将其作为双歧促进因子 (bifidus factor,简称BF)添加进培养基中[3],达到优化培养基的目的;同时,为开发新的双歧保健饮品提供 理论基础. 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 中药材 枸杞(Lycium barbarum),甘草(Glycyrrhiza uralensis),葛根(Pueraria lobata),山药 (Dioscorea oppositaThunb)等几种天然中药原料,均购自成都同仁堂大药房. 1.1.2 菌种 青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis),由中科院微生物研究所提供,我们对该菌种 进行了活化. 1.1.3 培养基 采用TPY培养基[2]作为基础培养基,配置固体培养基时,另按1.8%加琼脂粉. 1.2 方法 1.2.1 中药原料处理 准确称量中药原料y按料水质量比1B10加入三角瓶中,置于80~90e水浴锅中 煎熬3h后用细密纱布过滤除渣,即得浸提物[4].浓缩浸提物至每毫升含药量为,将此浓度定为100%,依 次稀释至50%,25%,12.5%,6.25%等几个浓度,115e灭菌30min备用.不同浓度的浸提物按2%加到灭 过菌的5mL液体基础培养基中. 收稿日期:2003-05-15 作者简介:张火云(1973-),男,2001级硕士研究生. *通讯作者 2004年2月 第41卷第1期 四川大学学报(自然科学版) Journal of Sichuan University (Natural Science Edition) Feb.2004 Vol.41 No.11.2.2 菌种活化及培养 采用Hungate厌氧滚管技术[5]培养. 1.2.3 记数方法 采用比浊法和Hungate厌氧滚管技术计数[5,6]. 1.2.4 增菌培养基优化实验设计[7] 根据青春双歧杆菌的特殊营养要求和培养基设计原则[3],固定下 面成分的用量,MgSO4#7H2O 0.05%,Na2HPO41%,KH2PO40.6%,Tween-80 0.01mL,L-半胱氨酸盐酸 盐0.01%,蒸馏水100mL,初始pH7.0.采用正交实验设计两种增菌培养基,选用正交表L9(33),优化碳源 (A)、氮源(B)、中药浸提物的剂量(C).因素水平表见表1.37e下静置培养48h后测OD600nm和pH作为实 验指标. 表1添加中药浸提物的培养基正交实验因素水平(L9(33))* 水 平A:碳源(%) (葡萄糖,乳糖) B:氮源(%) (胰蛋白胨,大豆蛋白胨,酵母膏) C:浸提物(%) (中药浸提物) 1 A1:(0.6,1) B1:(0.33,0.2,0.6) C1-1:1,C2-1:1 2 A2:(0.8,0.8) B2:(0.67,0.4,0.2) C1-2:2,C2-2:2 3 A3:(1,0.6) B3:(1,0.6,0.4) C1-3:3,C2-3:3 * C1.枸记浸提物;C2.山药浸提物. 1.2.5 测生长曲线和pH值 生长曲线的测定:将活化稀释好的菌种培养液,按0.25mL量用一次性注 射器分别注入各6支5mLTPY和增菌培养基中,混合均匀,置37e恒温箱,分别培养0,12,24,36,48和 72 h,取样按照稀释法滚管计数.以培