产酶微生物的分离、纯化与.docVIP

产蛋白酶芽孢杆菌的基本研究 生物科学与工程学院 生物工程111 第四组 【】芽孢杆菌（Bacillus），细菌的一科，能形成芽孢（内生孢子）的杆菌或球菌。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。芽孢杆菌（bacillus） 杆菌科的一属细菌。许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。 【】【】酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。目前，能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。 1．酪素培养基：牛肉膏0.3g、NaCl 0.5g，酪素 1.0g，琼脂 2.0g，水100mL， pH 7.6-8.0。配制方法：称取酪素1g，先用少量2%NaOH润湿，玻璃棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至100mL，加入其他成分，调整pH值，灭菌备用。显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒1 mL无菌吸管、玻璃涂棒、血细胞计数板、显微镜、紫外线等（15W）、磁力搅拌器、台式离心机、震荡混合器土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液；蛋白酶的产生菌株、溶液和试剂、碘液、无菌生理盐水、无菌水试管等； 1）采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液；2）取1：10土壤悬液5ml，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75-80 水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌；3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置，于30-32 培养24-48 h；4）对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。 ）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种含酪蛋白的斜面培养基，再点接于含酪蛋白的平板，30-32 培养24-48 h，测定平板上菌苔直径和水解圈直径。）水解圈直径与菌落直径比值大的那个菌株对应的斜面培养物，可作为进行诱变选育1）菌悬液的制备：取培养48小时生长旺盛的出发菌株斜面4-5支，用10 ml 无菌生理盐水将菌苔洗下，倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。将上述菌液离心（3000 r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2-3次，最后制成菌悬液用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个2）平板制作：将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55左右时倒平板27套，凝固后待用。 3）紫外线处理： 将紫外线灯开关打开，预热约20分钟。 取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述调整好细胞浓度的菌悬液3ml，并放入一根无菌搅拌棒于平皿中。 将上述2套平皿先后置于磁力搅拌器上，打开皿盖，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟和3分钟。盖上皿盖，关闭紫外灯。 4）稀释：在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。5）涂平板：取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。6）培养：将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。 7）计数：将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。 （8）观察诱变效应将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5-6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。 紫外线诱变结果 稀释倍数 平均菌落 处理时间 （数/皿） 诱变剂 （min） 10-4 存活率% 致死率% 紫外线 （UV） 0（对照） 1 114 53.02% 46.98% 3 13 6.05% 93.95% 2）观察诱变效应，并填入下表；