曲霉微生物转化黄山药的研究.docVIP

曲霉微生物转化黄山药的研究‘ 摘要:报道以单一菌株纯培养的固态发酵方式,选用黑曲霉(YM33182)和微紫青霉(YM3213)分别对黄山药 中药材进行微生物转化研究.采用硅胶色谱和凝胶色谱技术,从菌株YM33182转化产物中分离得到4个单体化 合物,通过波谱数据分析,分别鉴定为p一胡萝卜贰(daucosterol)(I),薯裁皂昔元次皂昔元B(ProsaPogeninB) (n),薯茨皂昔(Dioscin)(m),纤细薯菠昔(Grac皿n)(W).而从菌株YM32139转化产物中分离到一个主要的化 合物,鉴定为薯孩皂昔元(diosgenin).TLC及HPLC分析,pr0SapogeninB在菌株YM33182转化产物中的质量分 数高达10.77%;而diosgenin在菌株YM32139转化产物中的质量分数为20.85%. 关键词:黄山药;曲霉;微生物转化;化合物 黄山药(D如coreapanthoica)是我国特有的薯 菠科、薯菠属植物.其根状茎的主要有效成分为是 薯裁皂昔,具有治疗心肌缺血、抗血小板凝聚、降血 脂等作用〔’,2〕.微生物转化是利用微生物生长代谢 过程中产生的酶对特定底物进行结构修饰的化学 反应〔3〕.微生物转化技术具有反应条件温和,程序 简单,产品纯度高,不污染环境等特点,展示出广阔 的应用前景[’].采用生物转化的方式处理中草药, 将其用于复杂天然药物的筛选和研制,并与高效快 速的药物筛选手段结合,是发掘天然高效活性先导 化合物的重要途径困. 本文利用单一菌株的固态发酵方式,直接对中 药材黄山药进行微生物转化研究,为探究黄山药有 效成分的结构新颖性和多样性,发掘新型药物先导 化合物,寻找防治人类疾病天然药物成分开辟又一 条途径. 1材料与方法 1.1菌种黑曲霉A,e嗜illusni岁r(编号 YM33182),分离自云南大围山土壤.微紫青霉 Penieilliumjanthinellum(编号YM32139),分离 自云南罗平多依河杉树林土壤.2株菌均保藏于云 南大学微生物研究所. 1.2黄山药薯茨科植物黄山药(Dioscoreapan- thaica)的根茎干粉(〕0.216mm),云南产中药材. 1.3培养基马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基, 马铃薯葡萄糖液体(PDB)培养基,固体转化培养基 (m(黄山药干粉):m(鲜豆渣):m(水)=1:1: 0.2). 1.4仪器日本EYELA旋转蒸发仪,德国Wa- ters高效液相色谱仪,BrukerAVDRX50()型核磁 共振仪(TMS为内标). 1.5药品和试剂薄层色谱及层析色谱柱用硅胶 G(均为青岛海洋化工厂生产).乙睛(色谱纯),水 (超纯水),甲醇,乙醇(95%),氯仿,丙酮(均为国产 化学纯). 1.6微生物转化以固态发酵方式,将活化好的 菌种斜面接人三角瓶中(50mLPDB培养基/250 mL三角瓶),摇瓶培养48h(28士2℃,200r/min), 即得一级种子.按5%一7%的接种量,取一级种子 转接人500mL三角瓶内装100mLPDB培养基 中,摇床培养3一4d(200“min,28土2℃),扩大为 收稿日期:2007一05一20 作者简介:张传会(1981一),女,硕士生,主要从事真菌资源及应用微生物学研究. 通讯作者:陈有为,E一mail:ywchen@y皿.edu.cn.第Sl期张传会等:曲霉微生物转化黄山药的研究 二级种子.再将二级种子按7土1%接种量计接人 固体转化培养基中,于28士2℃发酵12d后,即得 转化产物. 1.7转化产物的提取和化合物的分离纯化对转 化产物采用70%乙醇浸提3次,收集合并的浸提 液,过滤,滤液经真空旋转浓缩仪浓缩后,加人 90%乙醇,室温下放置过夜,过滤弃沉淀物,取滤液 于55℃下真空浓缩得浓缩物.以同样上述方法采 用95%乙醇纯化浓缩物2次,挥弃乙醇溶剂,置60 ℃下干燥后,即为转化产物乙醇提取物. 分别取不同菌株的转化产物乙醇提取物经硅 胶柱层析分离,以氯仿、氯仿一丙酮、氯仿一甲醇梯 度洗脱,凝胶柱层析纯化,获得化合物I一V. 1.8转化产物乙醇提取物的分析 1.8.1TLC分析展开剂:v(氯仿):v(石油 醚)二4:l;显色剂:乙醇一硫酸显色剂.3组对照: 黄山药乙醇提取物(CK一1),薯茨皂昔元(CK- 2),微紫青霉PDA发酵物(CK一3);转化产物和对 照样品均为乙醇溶解,毛细管点样. 1.8.2HPLC分析色谱条件:色谱柱选用Sym- metryC18柱(5拜m,4.6mmx250mm);流动相: 乙睛一水(98:2);流速:1mL/min;检测波长:203 nm;柱温:常温;进样量:ro拌L. 分析样品制备:精确称取转化产物乙醇提取物 及各对照样品一定量,分别置10mL容量瓶中,甲 醇