氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性.docVIP

实验三 氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性 一、实验目的 1、了解氮蓝四唑（NBT）法测定植物体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的基本原理。 2、掌握氮蓝四唑（NBT）法测定植物体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的基本操作方法。 二、实验原理 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 三、材料、仪器设备及试剂 （一）材料 水稻或小麦等植物叶片。 （二）仪器设备  高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为4000Lx），试 管或指形管数支。 （三）试剂 （1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。91.5ml0.05MNa2HPO4+8.5ml0.05M NaH2PO4 。（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。 （3）750μmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。 （4）100μmol/LEDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。 （5）20 μmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。 四、实验步骤 1、酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.52g于预冷的研钵中，加1ml预冷的磷酸缓 液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为4ml。取4ml于4℃10000r/min离心20min 上清液即为SOD粗提液。 2、显色反应 取10mL试管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下表加入各种溶液： 各溶液显色反应用量混匀后将1支对照管置暗处，其他各管于4000lx日光下反应20min（要 各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。 3、SOD活性测定与计算 至反应结束后，全部移入暗处，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管的吸光度。 注意：用放在暗处的缓冲液代替酶液的空白管调零，各试剂按比例混合好（3.5ml缓冲液+0.5ml甲硫氨酸+0.5ml氮蓝四唑+0.5ml EDTANa2+0.40ml蒸馏水），再加100ul酶液，核黄素0.5ml最后单独加入。总体积6.0mL 表10 SOD活性测定的试剂量 试管编号 1对照（不光照） 2对照（光照） 3 4 缓冲液（mL） 3.50 3.50 3.50 3.50 甲硫氨酸（mL） 0.50 0.50 0.50 0.50 氮蓝四唑（mL） 0.50 0.50 0.50 0.50 EDTANa2（mL） 0.50 0.50 0.50 0.50 蒸馏水（mL） 0.50 0.50 0.40 0.40 酶液 0 0 0.10 0.10 核黄素 0.50 0.50 0.50 0.50 测定结果 0 Ack AE1 AE2 表11 SOD活性测定（平行测定2次）的Abs 试管号 2对照（光照） 3 4 平行测定次数 第一次 第二次 第一次 第二次 第一次 第二次 吸光度A（Abs） 0.203 0.251 0.055 0.199 0.035 0.140 五、结果计算 计算公式：SOD（U/g.FW）=(Ack-AE)*VT/Ack/0.5/W/Vs 式中 VT-总酶液量（ml） Vs-所用酶液量（50ul） W-叶片鲜重 （g） Ack-用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度 AE-样品管吸光度 表12 SOD活性的计算 VT = 400uL Vs = 50uL W = 0.52g 平行侧定次数 第一次 第二次 样品管管号 3 4 3 4 SOD（U/g.FW） 0.224 0.255 0.064 0.136 六、实验结果分析讨论 10