2009 分子生物学实验-讲义.docVIP

《现代生物学实验》分子生物学部分 目 录 实验一 SDS法提取植物核酸……………………………………………………2 实验二 CTAB法提取植物核酸……………………………………………………2 实验三 DNA的纯化及利用紫外分光光度计检测DNA含量及纯度……………3 实验四 质粒DNA的提取 ………………………………………………………4 实验五 PCR技术扩增DNA………………………………………………5 实验六 质粒DNA酶切………………………………………………………6 实验七 DNA的琼脂糖凝胶电泳检测及目的DNA片段的回收………………7 实验八 DNA片段的重组………………………………………………9 实验九 大肠杆菌感受态细胞制备………………………………………………10 实验十 外源基因遗传转化……………………………………………………11 实验十一 转基因水稻GUS报告基因检测………………………………………12 实验十二 分子生物学实验设计………………………………………………… 11 实验一 SDS法提取植物核酸 一、实验目的 通过本实验了解SDS法提取植物组织总核酸的原理及方法。 二、实验原理 利用高浓度的SDS在较高温度下（55-65度）裂解细胞，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来，通过酚和氯仿抽提去除蛋白质、脂质、多糖等，通过RNase A 消化去除RNA，最后用乙醇沉淀DNA。该法操作简便，能满足大多数实验需要。 三、材料 市售新鲜豆苗，菠菜等。 四．仪器用品 1．用具 玻棒、烧杯（250毫升），离心管（100毫升）、研钵、量筒（100毫升）、分析天平、紫外分光度计，37OC水浴、离心机等。 2．药品配制 （1）研磨缓冲液（pH7.0）：分别称取一定量的NaCl、柠檬酸三钠和EDTA三种药品，定容于1000毫升蒸馏水中（0.45mol/LNaCl，0.045mol/L柠檬酸三钠，0.1mol/LEDTA）（3×SSC），再在定容好的溶液中按1%比例加入SDS，调pH到7.0。 （2）氯仿-异戊醇：按照氯仿：异戊醇=24：1比例配制。 （3）溶解DNA溶液（pH7.0）：即0.1×SSC 溶液，含有0.015mol/LNaCl，0.0015mol/L柠檬酸三钠。 （4）95%或100%乙醇4(C冰箱预冷 五、实验步骤 1.称新鲜豆苗或菠菜嫩叶1克，放在研钵内，加入与2-3ml的体积的研磨缓冲液，充分将植物组织研磨成为浆状物。 2.将750ul浆状物加入一个1.5ml离心管内，加入等体积（750ul）的氯仿—异戊醇混合液，盖上管盖，剧烈摇晃30秒钟，以脱除组织蛋白质，转移至1.5 ml离心管中。 3. 离心管平衡后，10000转/分离心5min，形成三层，小心的吸取上层含核酸的水溶液，弃去中间的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。 4.将收集的水溶液放入一个新的1.5ml离心管中，在72(C下继续保温3分钟（不要超过4分钟）以灭活组织内的DNA酶，然后迅速取出离心管，放在冰水浴中冷却到室温。 5.取0.5ml溶液转入1.5ml离心管，加等体积95%或100%预冷乙醇水溶液，玻棒取出核酸，溶于适量0.1*SSC中，以待纯化使用。 五、作业 1. 在本实验中所用SDS在提取核酸过程中有何作用？ 2. 在上清液中加入95%（或100%）乙醇后，你看到出现的核酸是什么状态？ 实验二 CTAB法提取植物核酸 一、实验目的 通过本实验了解CTAB法提取植物组织核酸的原理及基本操作步骤。 实验原理 植物细胞中DNA主要存在于细胞核内，称核DNA或染色体DNA，细胞质中含有少量的DNA，分布在线粒体和叶绿体内。植物细胞内的各种DNA总称为总DNA。核DNA分子呈极不对称的线状结构，一条染色体为一个DNA分子。高等植物的核DNA约为109bp，如此细长的分子对任何机械力的作用都十分敏感。在DNA提取过程中，DNA分子的降解很难避免，因此提取得到的只是DNA分子的片段。 植物DNA的提取常用有CTAB（十六烷基三乙基溴化铵L?:60.57g Tris,pH8.0 (2) CTAB分离缓冲液 2%CTAB(W/V), 1.4mol/LNaCL,20mmol/LEDTA,100mmol/L Tris-HCL(pH8.0), 0.2%巯基乙醇共100mL：2g CTAB, 8.18g NaCL, 0.74g EDTA.Na2.2H2O，加入10mL 1mol/L的Tris-HCl(pH8.0), 0.2mL巯基乙醇，加水定容到100mL。 (3) 70%的乙醇，异丙醇，氯仿-异戊醇（24:1），液氮 (4)TE缓冲液 10mmol/L Tris-HCL（pH7.4）,