2011分子生物学实验讲义8.docVIP

生物工程教学实习-分子基础实验 实验一(1) 大肠杆菌感受态制备及外源DNA的转化 一、实验目的 1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。 3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。 二、实验原理 转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用 RM 符号表示。 转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法。感受态细胞：的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。 本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。 pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。 影响转化率的因素 细胞生长状态和密度。转化的质粒 DNA 的质量和浓度。试剂的质量。防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。 三、实验仪器、试剂 超净工作台；台式高速冷冻离心机；恒温空气摇床；恒温培养箱；培养皿 大肠杆菌DH5α LB培养基，（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g,溶解到1升蒸馏水中，调PH7.0,灭菌） 0.1mol/LCaCl2溶液（预冷） 氨苄青霉素 pUC18质粒 四、实验步骤 菌株活化 1．用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时 2．挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时 3．将培养液全部转到100mlLB培养基中培养12小时，到OD600＝0.3－0.8 感受态细胞制备 4．将培养液8mL在冰上放置15－30min，4000rpm离心5min,弃上清（4度） 5．加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，转入1.5ml离心管中 6．冰上预冷30min，4000rpm离心5 min,弃上清 7．加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使用。 转化 8．吸取200ul感受态细胞转移到无菌的离心管中，每管中加入质粒DNA1ul(不超过2ul),于冰上放置30min，设置对照不加质粒只有感受态细胞。 9．于42℃水浴90S（增加DNA吸收） 10．冰上放置2min 11．加入800μlLB液体培养基于37培养1小时 12．将200ul培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上（可以设置涂布20uL对照） 13．将平板放置于37℃恒温培养箱中培养14-16个小时，然后观察结果 对照组 吸取200ul感受态细胞转移到无菌离心管中，加入2 ul无菌水，于冰上放置30min，接着9步做下去 转化率 氨苄储备液;100mg/mL,卡那储备液50 mg/mL,培养基中总浓度为:氨苄50ug/ml,卡那，25 ug/ml。固体培养基在60℃以下添加。 五、实验报告 画出实验结果的示意图并做分析，计算转化效率（质粒0.05ug/uL*10uL）。 实验一(2) 转化子DNA的快速鉴定 一、实验目的 1、选择性培养基上的转化子为材料检测重组质粒DNA分子的大小，选出合理的重组的转化体菌株。 2、掌握快速细胞破碎法，测定大小不等的质粒DNA。 二、实验原理 利用Cracking gel缓冲液，采用快速细胞破碎法直接从菌体中提取DNA 三、实验操作 转化子鉴定步骤： （1）挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的50ml LB中，37℃振荡培养至A590值为0.6～0.8。 　　（2）取1.2ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm离心9min，去尽上清。 　　（3）加入70μl Cracking Gel缓冲液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,20%SDS 10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚蓝1.67ml，加双蒸水至200ml]，混匀后，37℃水浴30min以上。 　　（4）15000rpm离心15min。 　　（5）（实验三）吸取上清点样电泳，观察。 思考题 1、Cracking gel中各成分的作用分别是什么？ 2、