DNA的定量测定(二苯胺法)实验报告.docVIP

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DNA的定量测定(二苯胺法)实验报告.doc

DNA的定量测定(二苯胺法)实验报告 实验目的 掌握用二苯胺法定量测定DNA含量的基本原理和方法。 实验原理 在酸性环境中加热,DNA被水解为嘌呤,脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸。其中脱氧核糖在酸性条件下,脱水生成ω-羟基-y-酮基戊糖,后者与二苯胺作用呈现蓝色,在595nm处有最大光吸收。当样品DVA的含量在40-400μg范围时,光密度与DNA的浓度成正比。 样品中含有少量RNA不影响测定结果,但是蛋白质,脱氧核糖,阿拉伯糖和芳香醛等能与二苯胺形成各种各样有色物质,干扰结果。在反应中加入少量乙醛,可以提高反反应灵敏度。 试剂与仪器 DNA标准液,二苯胺试剂,样品溶液 试管与试管架,吸管与洗耳球,可见分光光度计 DNA标准液曲线的制作与样品DNA含量的测定 取8支洁净干燥的试管,按下表操作: 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 标准DNA溶液 - 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 - - 蒸馏水 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 - - -- 二苯胺试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 样品DNA溶液 - - - - - - 2.0 2.0 混合后,于60度水浴中保温1h 冷却至室温中,用分光光度计测定吸光值A595nm 以DNA浓度为横坐标吸光值A595nm为纵坐标,绘制标准曲线,对照组标准曲线计算样品中DNA的含量 实验结果与讨论 DNA标准试管 1 2 3 4 5 6 试管1 试管2 Y:吸光度 0.000 0.129 0.260 0.369 0.518 0.676 0.399 0.386 X:总DNA浓度(μg) 0 13.3 26.7 40 53.3 66.7 X1 X2 由图可知,标准曲线为y=0.0098x,则求出的 X1=40.71μg/ml,X2=39.39μg/ml 平均DNA浓度为40.05μg/ml,含量n%=40.05/100%=40.05% 分析:由实验的标准曲线求得的DNA浓度40.05μg/ml,在40-400μg范围内,光密度与DNA的浓度成正比,用标准曲线求得的浓度为准确值,另外,由DNA的标准曲线的线性关系R2 = 0.9966,证明DNA光密度的关系密切,则求出的浓度也就比比较精确。但本实验测得的DNA含量比整体水平偏低,造成的原因可能是: 在吸取DNA溶液样品时,未充分摇匀,便吸取2.0mlDNA样液,造成DNA含量不均,造成实验存在误差,另外,在加完试剂后,未摇后便至于60度水浴保温,造成二苯胺与DNA的脱水物结合不充分,造成吸光值的偏低,从而造成后续的计算,样品DNA浓度偏低。 进行分光光度测量时,可能由于比色皿未充分洗涤,有少量自来水的残留,相当于稀释了样品DNA浓度,使测得DNA吸光值偏低。 在吸取二苯胺试剂分别加入8支试管时,由于采用了不同试瓶的二苯胺溶液,造成试剂间存在部分差异,导致DNA的脱水物结合情况有所差别,影响最后DNA吸光值的测定。 思考题 如何定何判断某些样品是否有核酸? 答:取了4支试管,按下表操作(ml): 编号 1 2 3 4 样液 2.0 - 2.0 - 蒸馏水 - 2.0 - 2.0 地衣酚 - 2.0 2.0 - 二苯酚 2.0 - - 2.0 沸水浴中加热10min 观察试管内颜色变化,若1管变蓝,4管不变,则样品中含DNA,若3管变变绿,2管无变化,则样品中含RNA,若2,3管不变绿,则样品中不含RNA,若样品中不含RNA,含1,4管不变蓝,则样品中不含DNA。 实验中加入乙醛的目的是什么? 答:加入乙醛后,增加了二苯胺在溶液中的溶解度,同时使得DNA的显色量加深,便于观察和增加测定对DNA含量的灵敏度,另外又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖等的干扰。

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