同工酶实验2011.pptVIP

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶（活性染色鉴定法） 实验目的： 理解同工酶的概念及遗传学意义 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术 掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理 天然状态生物大分子进行的电泳，利用蛋白质分子中所带净电荷、分子质量、形状的差异，而在电场中泳动的速度和方向不同，达到分离的目的。 多数蛋白质的pH在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中进行电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁移，称为阳极电泳； 对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而向阴极迁移，称为阴极电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型 相同孔径的凝胶、缓冲系统，是利用蛋白质分子的主要靠电荷和分子筛效应进行分离。 1.凝胶储备液： A储备液： pH8.9 Tris~HCl缓冲液：1 M HCl 48ml，36.6g Tris，加 双蒸水到 80ml，调节pH到8.9定容到100ml。 B储备液 ： pH6.7 Tris~HCl缓冲液：1 M HCl 48ml，5.98g Tris，加双蒸水到80ml，调节pH到6.7定容到100ml。 C储备液： 分离胶储备液（30% Acr/Bis）：30g Acr，0.8g Bis，用双蒸水定容到100ml，备用，4℃存放可以保存1个月。 D储备液： 浓缩胶储备液：16g Acr，4g Bis，用双蒸水定容到 100ml，备用，4℃可以保存1个月。 E储备液： 10% Aps（W/V）：1g定容到10ml，-20℃保存。 F储备液： 40%蔗糖：40g蔗糖溶解到60ml双蒸水中。 TEMED 器材： 夹心式垂直板电泳槽，梳子，直流稳压电源（电压300-600V，电流50-100mA），移液枪（各种量程），烧杯（100mL），培养皿 取材：鲫鱼若干条，解剖取眼、鳃、肺、肝、肠、肉、卵 、心脏，放入冰箱保存。 提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液Tris-Hcl(pH=7.0) 此溶液需4℃预冷，组织重量（g）与缓冲液体积（mL）之比为１：5。用研钵研磨充分。浆液4℃离心约30分钟，15000转／分钟。 取上清液至新管，吸取其中150ul样品，加100ul 甘油和10ul溴酚蓝，混匀之后即可点样。 三、分离胶的制备 TEMED最后一个加入，轻轻混匀，操作迅速。胶高度距样品凹玻璃板下缘约1cm，用移液枪在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，并使胶面平整。 水与凝固的胶面有折射率不同的界限，用滤纸吸去多余的水。 四、浓缩胶的制备 TEMED最后一个加入，轻轻混匀，操作迅速。浓缩胶液高度到凹玻璃板下缘0.5cm左右，然后插入样品梳，注意不要产生气泡。约30分钟后，凝胶完全。 小心拔出样品梳（两端同时向外拔）。 五、电 泳 电压和电流：电压180V， 电流流18－30mA； 溴酚蓝跑至分离胶末端，电泳结束。 六、染色与观察 揭去上面长型玻璃板，凝胶从短型玻璃板上剥离，慢慢地把胶板冲入白瓷盘或大培养皿内，避光于37度摇床中染30min。 观察拍照 思考题： 根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳？哪些是关键步骤？ 为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和甘油溶液？分别有何用途？ 谢谢 附：分离胶、浓缩胶配方 * * 同工酶 是指能够催化相同的化学反应，但酶分子结构、理化特性乃至免疫 学性质不同的一组酶。它们是由遗传体系决定的在不同组织中表达 的蛋白质作用相同,但分子结构、理化特性等不同。 本实验做的是乳酸脱氢酶（LDH）的分离鉴定。 夹在两块玻璃板之间的凝胶 电泳缓冲液 电泳缓冲液 加在槽中的样品 分子量小 分子量大 电源 电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。 混合样品 带孔胶 按分子大小分离 电泳方向 电泳 小分子 大分子 不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，浓缩效应，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有分子筛效应。 不连续系统 连续系统 一、动物组织的样品的获取 二、试剂的配制、仪器的准备 三、分离胶（30分钟） 四、浓缩胶（20分钟） 五、电泳（2-3小时） 六、染色（30分钟） 七、观察结果 实验流程 一、试剂： 2.电泳缓冲液： Tris6.0g，28.8gGly 加双蒸水到900ml调节pH到8.3，定容到1000ml，使用 时稀释10倍