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基因变异的研究方法和新进展 基因变异广义上说就是指基因结构变化从而产生了可遗传的变异。也就是说DNA水平上的突变造成的基因改变。而这一突变过程可能有很多原因，有自发性的，比如DNA配对过程中的装配错误，也有外源性的诱导因素，如物理，化学，生物因素等造成染色体结构改变或者基因结构的直接变化。 突变的形式多种多样，常见的有：点突变，即一个或多个核苷酸发生了改变；框内突变指的是3个或是的倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢失或增加1个或几个氨基酸；除此之外，还存在着DNA大片段的缺失，通常是指几百个bp至几十个kb的碱基缺失或复制。 这其中，最常见的莫过于点突变，他是指一个或者几个核苷酸的缺失或改变，通常会形成三种类型，第一种是同义突变，即碱基替换后，虽然密码子发生改变，但编码氨基酸没有改变（遗传密码的兼并性），亦称静止突变，第二种是错义突变，指的是碱基替换，密码子发生改变后，编码氨基酸亦发生改变，编码另一个氨基酸，第三种是无义突变，即碱基替换后，使编码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。 基于上述的变化，常见的基因变异研究方法有如下几种 限制性酶切原理：限制性片段长度多态性（RFLP） 它的基本原理是当突变影响到某一限制性内切酶位点时，可通过酶切PCR产物，比如限制性内切酶MST II可以识别—CCTNAGG—，并利用这一事实去检测待测样品中相应位点是否发生了变化，从而检测出差异。 二．杂交原理：Southern blot，寡核苷酸杂交，芯片(chip) 1.Southern blot是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。 2.等位基因特异性寡核苷酸杂交（?ASO）要求设计两段寡核苷酸探针，其中包含发生突变的位点，一段与野生型链互补，一段与突变型链互补。从而杂交分析是否突变。 3.基因芯片：SNP位点的检测：测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交（Southern Blotting 和 Northern Blotting 等）技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。 三．单链局部二级结构形成：单链构象多态性（SSCP) SSCP是一种简便的点突变检测技术。PCR扩增产物变性形成单链后，其构象及电泳迁移速度可因单个碱基突变而出现差异并形成多态性。在低温条件下，单链DNA呈现一种由内部分子相互作用形成的三维构象，它影响了DNA在非变性凝胶中的迁移率。相同长度但不同核苷酸序列的DNA由于在凝胶中的不同迁移率而被分离。迁移率不同的条带可被银染或者荧光标记引物检测，然后用DNA自动测序进行分析。用PCR-SSCP 技术可以进行序列差异的测定，而敏感度会随着片段长度的增加而降低。 四．异源双链体形成 1变性高效液相色谱分析（DHPLC）用来检测基因杂合突变，经变性和复性后产生.他的原理是在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差异，发现DNA突变。异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。 2.异源双链体形成分析（HA） 3.高分辨率熔解曲线（HRM） 五．截短蛋白分析：体外蛋白截短实验（PTT） 这是一种从蛋白质水平检测基因突变的方法。其原理是碱基缺失和插入导致的移码突变、碱基替换出现的无义突变均可使基因提前出现终止密码，从而截短mRNA翻译的蛋白质。其操作过程如下首先合成RT-PCR的上游引物T7：GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCATGG 。然后[35S]甲硫氨酸，T7 体外转录/翻译体系（兔网织红细胞提取物）完成体外蛋白质合成。最后SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 六．定量多重PCR技术（QM-PCR） 这项技术是在同一PC