几种蛋白的提取.docVIP

（一）小麦种子谷蛋白的提取（检测） 一粒或半粒小麦种子砸碎 加1mL 70%乙醇，振荡30min 13000rpm离心10min，弃上清 沉淀加入1 mL 55%异丙醇，振荡混匀（必要时用解剖针搅匀），65℃水浴30min 13000rpm，10min弃上清 沉淀加入1 mL 55%异丙醇，同上再重复2次（共3次） 加入100μl（根据沉淀的量，适当增减）溶液B（含1%DTT）:（ 1 mL溶液B 加0.01gDTT） 65℃水浴30min(间振3-4次) 加入100μl（根据沉淀的量，适当增减）溶液B（含1.4% 4-乙烯基吡啶）1mL溶液B加14μl的4-乙烯基吡啶 65℃水浴30min(间振3-4次) 13000rpm，15min，上清即为谷蛋白溶液 吸取50μl上清，再加60μl 2×loading buffer，-20℃保存 SDS上样前样品的处理： 1、取样品，65℃水浴30min 2、上样量：大胶：12-15μl 小胶：10μl（两侧点样孔若点loading buffer，则条带较平直） 谷蛋白提取相关试剂 1、 1M Tris-HCl(pH8.0，500 mL) 称取Tris 60.57g，加350 mL Milli-Q溶解，再加浓HCl调节pH为8.0，最后定容至500mL 2、solutionB 50%异丙醇 8% Tris-Hcl(1M, pH8.0) 3、2×SDS loading buffer （100 mL） 1 M Tris-HCl(pH8.0) 8mL 甘油 40 mL SDS： 2g 溴酚蓝 0.02 g Milli-Q 补水至100 mL （二）谷蛋白的提取（ for HPLC） 第一步：提取蛋白（同检测提法） 第二步：蛋白沉淀 1.全蛋白： 上清加入丙酮（使丙酮含量为60%，如120μl丙酮，80μl样品），-20℃沉淀过夜，13000rpm，10min，沉淀即为全谷蛋白（HMW+LMW），-20℃保存 2. HMW-GS：上清加入丙酮（使丙酮含量为40%，如80μl丙酮，120μl样品），-20℃沉淀过夜，13000rpm，10min，沉淀即为HMW-GS，-20℃保存 3. LMW-GS: 上清加入丙酮（使丙酮含量为40%，如80μl丙酮，120μl样品），-20℃沉淀过夜，13000rpm，10min，取上清，加入丙酮（使丙酮含量为80%，如400μl丙酮，200μl样品（样品中还含有80μl丙酮）），-20℃沉淀过夜，13000rpm，10min，沉淀即为LMW-GS，-20℃保存 第三步：洗蛋白（乙腈有毒，TFA极易挥发，操作在通风橱进行） 1. 13000rpm，10min，弃上清 a. 用1mL无水乙醇洗涤沉淀，混匀涡旋后8000rpm，5min，弃上清 b. 用500μl 0.07%巯基乙醇的丙酮溶液（7μl到10mL，现用现配）（7μl到10mL，现用现配）洗涤沉淀，混匀涡旋后10000rpm，5min，弃上清 2.室温干燥 3.加50μl溶解液（50%乙腈5mL+0.05%TFA5μl + Milli-Q 5mL）充分混合，溶解为止 （三）种子清球蛋白的提取（for 2DE） 实验之前要提前准备研钵和液氮；预先称0.025gDTT于10mL离心管中 1.样品的研磨转移（为避免转移过程中蛋白损失太多，蛋白提取液可酌情增加） 称取小麦种子0.5g，用液氮研磨至细粉状（约20min） 将研磨放置于通风橱下，加入50μl的PMSF溶液和1mL蛋白提取液 继续研磨至液体，并将之转移到已有DTT的10mL离心管中 用1.5mL蛋白提取液分2-3次洗涤研钵，并转移到10mL离心管中 2.样品的处理（1） 样品涡旋1min 超声波处理（15次，2S, 2S） 4oC放置2h（间振3-4次） 提前30min将4oC离心机打开 3.样品的处理（2） 4oC ，13000rpm，15min 取上清再离心4oC ，12000rpm，5min 取上清，加1.2倍体积Tris-平衡酚（取下层酚液） 冰浴10min 4oC ，13000rpm，30min 取上清（千万不要取上来下层的物质），4oC ，13000rpm，20min 取上清，加5倍体积乙酸铵/甲醇溶液，-20 oC沉淀（至少4h） 4.样品的洗涤 取出样品，4oC ，13000rpm，10min 沉淀用0.02g DTT/10mL丙酮悬浮（后者提前放入-20oC预冷），4oC ，13000