细菌质粒DNA的微量制备.docVIP

细菌质粒DNA的微量制备、酶切和琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的和要求 1．掌握碱变性法提取质粒的原理和方法。 2．掌握核酸浓度测定方法、酶切技术。 3．掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和实验技术 二、基本原理 质粒（Plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，是染色体外能够稳定遗传的因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主的进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生型的自主复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。 大肠杆菌染色体DNA比通常用作载体的质粒DNA分子大得多，在提取得过程中，染色体DNA易断裂成线性DNA分子，而大多数质粒DNA则是共价闭环型，根据这一差异便可以设计出各种分离、提纯质粒DNA的方法。 在EDTA存在的条件下，用溶菌酶破坏细菌细胞壁，同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜