组蛋白H2A衍生抗菌肽的重组表达及活性分析.docVIP

组蛋白H2A衍生抗菌肽的重组表达及活性分析 【摘要】：目前,由于食品生产、农业生产和医药卫生等领域中抗生素的广泛使用,造成病原菌耐药性的提高以及抗生素残留等诸多危及人类健康的问题。因此,目前人们急需寻找一种高效、广谱、安全的新型抗菌剂替代传统抗生素。由于抗菌肽独特的抗菌机制,不易使病原菌产生耐药性,具有广谱的抗菌活性等优点,它在治疗学领域,畜牧业,食品防腐剂等己被用来作为新一代的抗微生物剂。已报道的抗菌肽超过2000种,这些抗菌肽携带净正电荷并且大多数倾向于形成两亲的α-螺旋结构。组蛋白衍生的抗菌肽(histone-derivedantimicrobialpeptides,)是组蛋白在某种机制作用下被降解、修饰和分泌出的一种小分子多肽。基于HDAPs具有体外抗菌活性,本研究在对四膜虫及人类组蛋白H2A分析的基础上,通过基因工程技术,构建四膜虫及人类组蛋白H2A衍生的抗菌肽的高效融合表达载体,在大肠杆菌表达系统成功实现四膜虫组蛋白H2A衍生抗菌肽(Tetrahymenathermophilahistone-derivedantimicrobialpeptides,ThAP)和人类蛋白H2A衍生抗菌肽(Humanhistone-derivedantimicrobialpeptides,HhAP)的重组表达,对重组蛋白的抑菌活性进行研究,实验结果如下：(1)ThAP和HhAP基因的设计合成根据四膜虫及人类组蛋白H2A序列,设计H2A衍生的HDAPs:ThAP和HhAP肽序列,利用大肠杆菌偏爱密码子表,合成在大肠杆菌中高效表达的组蛋白衍生物抗菌肽基因片段ThAP和HhAP,并构建于克隆载体pUC57上(2)ThAP和HhAP生物信息学分析通过抗菌肽数据库网站及SOPMA程序在线分析了ThAP和HhAP氨基酸残基的分子量大小、净电荷数、两亲性、等电点、二级结构及三级结构等,预测结果显示：ThAP和HhAP蛋白质分子量分别为2.15KD.2.22KD:ThAP主要由α螺旋结构组成,占57.89%,HhAP主要由α螺旋(43%)和无规卷曲结构(38%)组成。(3)重组表达质粒的构建及GST-ThAP和GST-HhAP的表达及纯化将重组质粒pUC57-ThAP和pUC57-HhAP用BamHI和XholI双酶切,目的基因与表达载体pGEX-4T-1连接,获得pGEX-4T-1-ThAP和pGEX-4T-l-HhAP重组表达质粒。重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21株中,获得重组工程菌株BL21/pGEX-4T-1-ThAP和BL21/pGEX-4T-1-HhAP.0.1mMIPTG,37诱导4h,GST-ThAP和GST-HhAP表达,GST琼脂糖亲合层析柱分离纯化得到融合蛋白GST-ThAP和GST-HhAP。(4)GST-ThAP和GST-HhAP活性检测GST-ThAP(ThAP)/GST-HhAP对革兰氏阴性细菌大肠杆菌(DH5α)和革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌的抑菌活性结果显示：融合蛋白GST-ThAP和GST-HhAP对G+和G-细菌均有抑制作用,融合蛋白GST-ThAP比GST-HhAP对DH5α抑制作用明显；GST-HhAP比GST-ThAP对金黄色葡萄球菌抑菌活性强。划痕擦伤迁移实验检测GST-ThAP/GST-HhAP/ThAP蛋白对C6细胞迁移的影响,结果表明,培养8h时,实验组与对照组迁移速度基本相同；培养20h时,迁移率大小为：TrisGST-ThAP(5uL)GST-ThAP(15uL)ThAP(5uL),GST-ThAP和GST-HhAP显著抑制C6细胞迁移。综上所述,本研究构建了四膜虫及人类组蛋白H2A衍生的抗菌肽ThAP和HhAP的重组表达载体,在大肠杆菌中成功表达,并且对其融合蛋白活性及功能进行了初步的分析,为ThAP和HhAP应用及组蛋白衍生抗菌肽的深入研究提供了理论基础和依据。【关键词】：H2AThAPHhAP抗菌活性表达纯化 【学位授予单位】：山西大学 【学位级别】：硕士 【学位授予年份】：2013 【分类号】：TQ465 【目录】：中文摘要8-10ABSTRACT10-12第一章文献综述12-211.1抗菌肽概述12-181.1.1抗菌肽的结构特征与分类12-141.1.2抗菌肽的作用机制14-171.1.3抗菌肽的功能171.1.4抗菌肽的制备方法171.1.5抗菌肽的开发应用前景17-181.2组蛋白H2A衍生抗菌肽的研究18-191.2.1组蛋白H2A概述181.2.2组蛋白H2A衍生抗菌肽的抗菌活性研究18-191.3本课题研究的意义19-21第二章组蛋H2A衍生抗菌肽的氨基酸序列分析及表达载体的构建21-332.1材料21-222.1.1菌株和质粒212.1.2主要酶及生化试剂21-222.