酶分子修饰.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。 定点突变（site directed mutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。 是蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。 * * * * * * * * * 杂交酶 杂交酶是指由来自两种或两种以上的酶的不同片段构建成的新型的酶。 首先，利用高度同源的酶进行杂交，可以将它们各自的优势进行互补，使新获得的杂交酶的特性介于其亲本酶的特性之间。 如：利用根瘤土壤杆菌 和淡黄色纤维弧菌 两者的B－葡萄糖苷酶进行杂交，构建出新的杂交B—葡萄糖苷酶，其最佳反应条件和对各种多糖的米氏常数，都介于两亲本酶之间。 其次，通过杂交可以创造具有新催化特性的酶，用它来调节现有酶的专一性或催化活性。迄今为止，几乎所有的杂交酶都属于此类酶。 创造新杂交酶的方法有多种，如可以利用功能性结构域的交换，以及向合适的蛋白质骨架引人底物专一性和催化特性的活性位点等方法。 第四节 物理修饰 一、定义 通过各种物理方法，使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法称为物理修饰。 二、特点 不改变酶的组分和基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理方法的作用下，副键发生某些变化和重排。 三、方法 压力、光、电、超声波。 例1：羧肽酶γ经高压处理后，底物特异性发生改变，合成能力增加，水解能力下降。 例2：用高压处理纤维素酶，最适温度从50～60℃降低到30～40℃，活性提高10％，从工业应用的角度来看可减少能耗。 物理法可预见性较差。 酶修饰后的性质变化 热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。 抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。 各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。 半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。 最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。 Km的变化：大多数酶经修饰后， Km没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。 五、酶蛋白化学修饰的局限性 1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。 2.化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变，因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。（修饰剂引起蛋白质构象变化——失活， 不一定是活性中心基团被共价修饰） 3.不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团，不易被修饰。 4.酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。 5.酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所“必需”的，为什么是必需的，还得用X射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。 第五节　酶化学修饰的应用 在医药方面：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长 它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性 和抗原性。 在工业方面：化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱 和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适pH等酶学 性质。 在酶结构功能研究中： 1.研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究； 2.确定氨基酸残基的功能； 3.测定酶分子中某种氨基酸的数量。 　研究酶活性中心的方法 1.物理学方法： 用X射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物（包括酶和底物）的相对位置。 2.化学修饰法：根据所用修饰试剂不同，分为 1)非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。 若某基团被修饰后： 酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团 酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基团 但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。 活性中心基团的鉴定标准 ①失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。 ②S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。 先加S或竞Ⅰ 加共价修饰剂 透析除去S或竞Ⅰ 活性不丧失 差别标记： 底物或抑制剂存在 活性基团不与修饰剂作用 去除底物或抑制剂