开心胶囊对复苏犬心肌细胞免疫炎症因子基因表达的抑制作用_医学论文.docVIP

开心胶囊对复苏犬心肌细胞免疫炎症因子基因表达的抑制作用_医学论文 开心胶囊对复苏犬心肌细胞免疫炎症因子基因表达的抑制作用_医学论文 作者：罗小星， 王大伟， 赵永华， 梁坚 【关键词】 开心胶囊 　　摘要：【目的】观察开心胶囊对复苏犬心肌细胞免疫炎症因子基因表达的影响，以寻求阻止心肺复苏后向全身炎症反应综合征发展的有效手段。【方法】选用健康杂种犬15只，随机分为假手术组、模型组和开心胶囊组，每组5只；复制心肺复苏模型，在自主循环恢复180?min后处死动物，摘取心脏；提取心肌组织总RNA，采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）法检测目的基因的信使核糖核酸(mRNA) 表达强度。【结果】模型组Toll样受体4（TLR4）和肿瘤坏死因子α（TNFα）mRNA的表达与假手术组比较有显著性差异（Ｐ＜００５）；开心胶囊组心肌组织TLR4 mRNA、TNFα mRNA和诱生型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表达受抑制，与模型组比较有显著性差异（Ｐ＜００５）。【结论】开心胶囊可能通过阻断或减弱免疫炎症因子基因的诱导，在一定程度上减轻复苏引起的心肌细胞的损伤。 　　关键词：开心胶囊／治疗应用；心肺复苏术； 细胞因子类；疾病模型，动物； 犬 　　心肺复苏后细胞因子的变化，最终可引起自身的免疫失控，导致全身炎症反应综合征（SIRS）的发生，在这种状态下，自身免疫失控所导致的损伤远远大于心肺复苏的损伤作用，是继发多器官衰竭（MODS）的重要原因［1］。 　　研究显示Toll样受体（Tolllike receptor，TLR）4，即TLR4作为跨膜受体在细菌内毒素介导的单核吞噬细胞免疫和炎症反应中发挥了重要作用［2］；而肿瘤坏死因子α（TNFα）与SIRS发病和死亡关系最密切，诱生型一氧化氮合酶（iNOS）在炎症时高度表达，催化NO（nitrioxide）大量合成，在SIRS的病理过程中发挥着广泛而复杂的作用。本实验采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）法，观察开心胶囊(由西洋参、香附、苍术、川芎、山栀、五灵脂、蒲黄、神曲、山楂等组成)对TLR4、TNFα和iNOS的的信使核糖核酸（mRNA）表达的调节作用，现报告如下。 　　1 材料与方法 　　11 材料与仪器 TKR300 CG电脑射流供氧呼吸器（江西特力麻醉呼吸设备公司）；ID80普通成人用气管插管（浙江大学医疗医学仪器厂）；组织RNA抽提试剂盒（德国Invisorb公司）；Onestep RTPCR Kit（大连宝生物工程公司）；PRB 322 DNA/MSPI Markers（华美生物工程公司）；Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400；Beckman Allegra 64R台式高速冷冻离心机；DYY8B型稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂）；2FAI紫外透射分析仪（上海光明仪器厂）；Beckman DU640 核酸紫外分析仪；凝胶成相分析系统（美国Laconco公司）。 　　12 方法 　　121 动物 选用健康杂种犬15只，体质量13～15 kg，年龄2～3岁，雌雄不限，用30?g/L戊巴比妥钠（1?mL#12539kg-1）腹腔注射麻醉，气管插管。 　　122 分组 所有动物随机分为3组，每组5只。其中假手术组仅行开胸假手术处理；模型组开胸致颤后常规复苏；开心胶囊组实验前以开心胶囊（每粒045g，本院制剂室提供），按给药剂量01g/kg加生理盐水混匀稍加热成稀糊状，拌入犬当日一部分饲料中，为保证给药准确性，在犬吃完含中药的饲料后再添加剩余的饲料，连续喂养5?d后供实验用。开胸致颤后常规复苏，复苏后不使用任何血管活性物质。 　　123 模型复制与复苏 于胸骨左侧第5肋间开胸，至隐约可见到胸膜时，即接电脑射流供氧呼吸机行高频射氧通气；剪开心包，缝制简易心包吊床，暴露心脏，以低压交流电（3V、25?mA、01s）诱发室颤，同时停止机械通气；持续4?min后，恢复机械通气，直至自主循环建立；在恢复自主循环180?min后放血处死动物，迅速摘取心脏。 　　124 RTPCR操作方法 ①心肌细胞总RNA的提取及定量：按照Invisorb公司试剂盒提供的方法进行操作；②RTPCR扩增产物：利用 Genbank数据库中提供的iNOS （Accesion：AF077821）、TLR4（Accesion：AB080363）基因序列，并采用计算机引物设计软件Primer 3设计；TNFα、甘油醛3磷酸脱氢酶（GAPDH）则直接引用国外文献所提供的引物序列。iNOS引物：Sense 5AAGATGGTGCAGCAAAACAGC3，位于iNOS cDNA序列的3491～3512碱基，Antisense 5GGTGCAATCAGATGAAAGTGCC3，位于iN