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杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达_医学论文 杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达_医学论文 作者：李金福, 陈建平, 杨志伟, 田玉, 马莹, 胡孝素 【关键词】 杜氏利什曼原虫,无鞭毛体蛋白基因,体外表达 　　Construction and expression of recombinant eucaryotic expression plasmid of amastin gene of Leishmania Donovani 　　[Abstract] AIM: To construct recombinant eukaryotic expression plasmid of amastin gene of Leishmania Donovani anddetectexpressionofthegeneinNIH3T3cells.METHODS: Amastin gene was amplified from nuclear DNA of Leishmania Donovani isolates and cloned into an eukaryotic expression vector pcDNA31(+). The recombinant plasmid was named pcDNA31amastin. NIH3T3 cell was transfected by pcDNA31amastin. Transient and stable expression of amastin gene were detected by immunofluoresence and RTPCR. RESULTS: It was found that there was high green fluorescence on the cell membrane and inside the cell. It showed that NIH3T3 cell was transfected by pcDNA31amastin successfully. CONCLUSION: A recombinant eukaryotic expression plasmid of amastin gene of Leishmania Donovani was successfully constructed, and can be expressed stably in the NIH3T3 cells. 　　[Keywords]Leishmania Donovani amastin gene express in vitro 　　[摘 要] 目的: 构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因的真核表达重组质粒pcDNA31amastin, 并研究其在NIH3T3细胞中的表达。方法: 提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增。将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA31(+)中, 构建真核表达重组质粒pcDNA31amastin。以pcDNA31amastin转染NIH3T3细胞, 采用免疫荧光染色法和RTPCR分别鉴定pcDNA31amastin的瞬时表达和稳定表达。结果: 在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光, 表明pcDNA31amastin成功地转入NIH3T3细胞, 并在细胞膜和细胞内获得短暂表达。稳定转染的NIH3T3细胞的总RNA经反转录后, 用PCR扩增出无鞭毛体蛋白基因, 表明获得了稳定表达。结论: 成功地构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的真核表达重组质粒, 并且该基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达。 　　[关键词]杜氏利什曼原虫 无鞭毛体蛋白基因 体外表达 　　杜氏利什曼原虫是一种胞内寄生原虫, 由媒介昆虫白蛉传播, 其引起的黑热病致死率极高, WHO/TDR已将其列为6种重点防治的热带病之一。因现有疫苗效果不够理想, 目前尚无可大规模用于临床的黑热病预防接种疫苗。因而, 寻找有效的、 新的黑热病疫苗候选分子已成为当今黑热病预防研究工作的重点。近年来, 对无鞭毛体蛋白(amastin)的研究[1, 2]使其有望成为一种黑热病疫苗的候选分子。本研究根据GenBank中登录的4种利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因的序列, 自行设计引物, 克隆了杜氏利什曼原虫的无鞭毛体蛋白编码基因, 并将其导入质粒pcDNA31(+)中, 构建了真核表达重组质粒pcDNA31amastin, 并在NIH3T3细胞中获得稳定表达, 为进一步构建黑热病无鞭毛体蛋白基因疫苗奠定了基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 杜氏利什曼原虫四川省汶川县人分离株(MHOM/CN/90