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短发夹状RNA 对GRP78基因在结直肠癌RKO细胞中表达的抑制作用_医学论文 短发夹状RNA 对GRP78基因在结直肠癌RKO细胞中表达的抑制作用_医学论文 作者：王丽丽 邢晓明 李玉军 【摘要】 目的 探讨短发夹状RNA对糖调节蛋白78(GRP78)在结直肠癌RKO细胞中表达抑制作用。方法以脂质体Lipofectamine 2000介导GRP78短发卡状RNA(shRNA质粒表达载体转染RKO细胞,G418筛选得到稳定表达株, 半定量RT和Western blooting方法检测GRP78 mRNA和蛋白水平变化。结果转染成功并筛选出稳定表达RKO细胞株。与对照组相比,shRNA转染RKO细胞GRP78的mRNA及蛋白水平均显著下降(t=7.079、7.510,0.05)。结论 shRNA能明显抑制RKO细胞GRP78 mRNA及蛋白的表达,为进一步在体内外研究GRP78在结直肠癌中的作用奠定了基础。 【关键词】 葡萄糖调节蛋白78结直肠肿瘤RNA干扰 [ABSTRACT] Objective To explore the supression of glucoseession in human colorectal carcinoma cells RKO by short hairpin RNA (shRNA) interference. Methods The shRNA plasmid expression vector (shRNAGRP78) was transfected into cells with Lipofectamine 2000. After selection with G418, the stable cell clones were attained. GRP78 expression was assayed with realtime quantitative PCR and Western blotting at both mRNA and protein levels. ResultsThe transfection was successful and stable RKO cell clones with shRNAGRP78 plasmid were obtained. Compared with the control, the shRNAGRP78 plasmid caused significant reduction of GRP78 expression at mRNA and protein levels (t=7.079,7.5100.01). Conclusion The shRNAGRP78 plasmid can significantly inhibit the expressions of GRP78 mRNA and protein levels, which establishes a foundation for further study, in vivo and in vitro, of the role of GRP78 in colorectal carcinoma. 　　[KEY WORDS] glucose 　　糖调节蛋白78(GRP78)，也称免疫球蛋白重链结合蛋白，是位于内质网上重要的分子伴侣，属于热休克蛋白70(Hsp70)家族成员[1]。GRP78的功能很多,作为一种分子伴侣参与蛋白质的折叠和转运,也是内质网上的一种应激蛋白,在葡萄糖缺乏、低氧和低钙等应激条件作用下,产生内质网应激反应,诱导GRP78过表达，以维持内质网的稳定。近年来研究结果表明，GRP78在多种人类肿瘤组织中高表达，并对肿瘤增殖、血管生成等有重要意义[2。本研究拟构建GRP78靶向短发卡状RNA(shRNA)质粒表达载体(shRNA，并采用脂质体Lipofectamine 2000转染到结直肠癌RKO细胞中，观察其对结直肠癌RKO细胞GRP78 mRNA及蛋白表达的影响，以期为结直肠癌的基因治疗提供理论依据。现将结果报告如下。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料与试剂 　　人结直肠癌RKO细胞系由浙江大学医学院分子病理学实验室馈赠。RPMI 1640培养基、Opti优化培养基及新生牛血清购自Gibco公司脂质体Lipofectamin 2000及TRIzol试剂均购自Invitrogen公司山羊抗人GRP78多抗购自Santa Cruz公司IRDye800 标记的二抗购自Gene公司GRP78的shRNA质粒表达载体套装试剂盒购自上海吉玛公司,其RNA干扰的靶序列为5′并命名为PGPU6/GFP/Neo阴性对照质粒(PGPU6/GFP/