PCR技术中几个重知识点分析.docVIP

PCR技术中几个重要知识点分析 张 俊（江苏省靖江高级中学 214500） 摘 要 本文重点对高中生物学教材中PCR技术的几个重要知识点进行分析解答。便于学生能够透彻理解PCR技术中的相关内容。 关键词 PCR配方 原理 过程引物　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中， Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。[1]31）采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。改PCR反应体系的主要成分应该包含：扩增缓冲液（含Mg2+）、水，4种脱氧核糖苷酸、模板DNA、_____________和_________________。 答案：TaqDNA聚合酶、两种引物。 解析：PCR反应体系的DNA聚合酶不是常见的普通DNA聚合酶，而是对热具有较强稳定性的DNA聚合酶该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本。PCR技术①DNA聚合酶不能从头合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链，当引物与DNA单链碱基互补配对结合以后，就提供了一个3’-OH末端给DNA聚合酶形成磷酸二酯键延伸DNA链，因此DNA解开两条链后，必须有两种相应的引物与之相结合，DNA的两条单链方能延伸②在PCR技术扩增[2] 2 PCR原理和过程PCR技术的基本原理DNA双链复制，PCR过程分为三步（如图所示）： 　　1）DNA变性（90℃-9℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA 　　2）退火（复性）（℃-60℃）：系统温度降低，引物与 DNA模板结合，形成局部双链。 　　3）延伸（℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。 　　每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量增加一倍。 　　现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如右图所示）。 图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。 ①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。 ②在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。 答案： (1)①15/16 ②三 解析：根据PCR过程PCR过程A为模板，D为等长片断的目的基因）。 A经过复制制制制制制A为模板的DNA分子，通过PCR三次循环，可用如下图示反映其复制过程。可进一步通过数学模型研究，若复制的次数为x，获取等长片断的目的基因数目为y，在原料充足，条件适宜的情况下，经过x次循环能产生2x个子代DNA分子，其中B和B’DNA片段在任何一次循环后，其数量永远都是各一个；C和C’ DNA片段的数目各为x-1；等长片断的目的基因数目为y=2X-2x；所有的DNA分子都含有引物，含引物1或引物2的DNA分子各为2x-1，因此本题就不难得出其答案。 3 PCR反应体系中的对引物引物引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 　　设计引物应遵循以下原则： 　　①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 　　②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 　　③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 　　④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 　　⑤引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 　　⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 ①第1组： ； ②第2组： 。 (3) PCR反应体