细胞生物学实验-细胞骨架的观察.pptVIP

实验四 细胞骨架的观察 细胞生物学实验 细 胞 骨 架 的 观 察 实验目的 实验原理 仪器、材料与试剂 实验步骤 实验报告及思考题 实 验 目 的 掌握用考马斯亮蓝R250染色观察动物和植物细胞微丝的方法。 实 验 原 理 细胞骨架（cytoskeleton）是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，包括微丝（microfilament，MF）、微管（microtubule，MT）、中间纤维（intermediated filament，IF）。 细胞（特别是真核细胞）中的骨架系统，不仅仅是活细胞的支撑结构，决定细胞的形状，而且与细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递、细胞分裂、基因表达、细胞分化、极性生长等生命活动密切相关。 仪器、材料与试剂 仪器：光学显微镜，温箱，细胞培养设备 材料：平皿，烧杯，载玻片（为区别细胞的正反 面，剪掉 一角），体外培养的贴壁生长细胞、植物、镊子 试剂：磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH 7.4），.2mol/L 磷酸盐 缓冲液（pH 6.8），M-缓冲液，1％Triton X-100 （用M-缓冲液配），0.2%考马斯亮蓝R250，3.0%戊二 醛（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制） 实 验 步 骤 实 验 步 骤 B 植物细胞的微丝观察 1）去植物茎表皮约1cm2，放入盛有0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 6.8）的 小烧杯中。 2）吸去缓冲液，用1%TritonX-100处理洋葱表皮25-40 min。 3）除去TritonX-100，用M-缓冲液充分洗3次，每次约10 min。 4）加3.0%戊二醛固定40 min。 5）用PBS洗3次，滤纸吸去残留液体。 6）0.2%考马斯亮蓝R250染色30 min。 7）用蒸馏水洗数遍，降低背景。 8）将样品置于载玻片上，加盖玻片，在光学显微镜下观察。 实 验 报 告 及 思 考 题 1 画出所观察到的微丝图像。 2 说明在实验中1%TritonX-100处理细胞的作用是什么？ 3 说明M-缓冲液的作用是什么？ 4考马斯R250和G250的区别是什么？ 5 考马斯R250和鬼笔环肽对细胞骨架的染色有什么区别，各有什么 优缺点？ 6 简述微丝动态平衡过程中各种条件及作用。 7 ATP在微丝动态平衡中所起的作用是什么？ * * 细胞骨架的观察 细胞骨架的观察 细胞骨架的观察 细胞骨架的观察 A 动物细胞的微丝观察 1）将细胞培养在盖玻片上，未致密时即可使用。取出盖玻片，用PBS 洗3次。 2）室温下用1%TritonX-100处理20-30 min。 3）用M-缓冲液轻轻洗细胞3次。 4）略晾干后，用3.0%戊二醛固定细胞10 min。 5）用PBS洗数次，滤纸吸干。 6）用0.2%考马斯亮蓝R250染片子30 min。蒸馏水冲洗，在空气中自然 晾干。 7）在光学显微镜下先用10×物镜再用40×物镜观察。 细胞骨架的观察 细胞骨架的观察 *