内皮细胞中高血糖减弱蛋白质亚硝基化.docVIP

内皮细胞高血糖减弱蛋白质亚硝基化 氧化应激作用 目标——高血糖诱导的血管内皮功能障碍，是通过一氧化氮（NO）的生物活性和生产过剩的缺陷，被视为与糖尿病相关的血管病变最重要的事件之一。但是高血糖损伤机制仍未清楚。我们假设，改变细胞蛋白质亚硝基化可能导致高血糖从而引起内皮功能障碍。 研究设计和方法——血管内皮细胞在活性氧抑制剂存在和缺乏时对高血糖使用生物素-亚硝基化的蛋白质以及与正常葡萄糖条件下培养的细胞相比，在使用生物素转化实验检测以分析其全部样本的改变。我们通过蛋白质谱分析和/或与特定的抗体的免疫印迹确定了内源性的S-亚硝基化。结果——高葡萄糖诱导显着降低内源性的S-亚硝基化的??蛋白质，包括内皮细胞一氧化氮合成酶、肌动蛋白、纽蛋白、甘油二酯激酶、GRP78，细胞外信号调节激酶1和转录因子核因子-B（NF-κB）。有趣的是，这些变化通过抑制超氧生产可以彻底还原，提示高血糖的条件下氧化应激调控S-亚硝基化起关键作用。此外，减少NF-κB化修饰的平行修复，通过降低阻断超氧抑制剂使高糖诱导NF-κB激活恢复。结论——蛋白质亚硝基化可以??改变高血糖对脉管的不利影响，如基础如内皮功能障碍和糖尿病的进行性血管并发症。 高血糖是现在公认的引起的微血管和大血管病变的主要致病因素。高血糖引发的一系列相互关联的生化反应直接影响细胞功能导致异常血管重塑和发展为糖尿病并发症。内皮功能障碍，其特征在于通过增加超氧化物生成一氧化氮（NO）的生物活性的损失，它被视为是最重要的细胞事件之一，造成不良高血糖对血管的影响。 NO由血管内皮细胞组成型表达，作为举足轻重的内皮衍生的调制器，维持正常的脉管系统的功能，通过其血管扩张剂，抗血小板、抗增殖、抗氧化剂和抗发炎的特性。NO生物活性的下降，以及由此产生在许多疾病的血管内皮功能障碍的发生。包括高脂血症，高血压，代谢综合征，糖尿病。大量的证据表明，无论是在体外还是体内，高血糖减少内皮NO的利用率和生物活性。高糖诱导的NO缺乏是内皮一氧化氮合酶（eNOS）的反应产生的净合成中的超氧阴离子自由基和NO的失活部分原因。然而，通过高糖条件下NO的生物利用度降低使下游信号事件增加很大程度上仍然未知。 NO和血红素的蛋白质（如鸟苷酸环化酶）的相互作用是NO相关联的事件中最被认可的信号，亚硝基化蛋白巯基代表一个重要的附加NO依赖的信号机制。迄今为止，S-亚硝基化已被确定为是具有广泛功能的100个蛋白的靶点。S-亚硝基化将会导致转移的亚硝鎓还原产生半胱氨酸残基，以调节活性的若干代谢酶，如蛋白酶、蛋白激酶/磷酸酶、受体、转录因子以及与各种细胞骨架及结构件。据报道，各种生理或病理生理条件下亚硝基化的蛋白质在血管内皮细胞和血管内皮功能的调节起着重要的作用。例如，治疗用的促炎性细胞因子肿瘤坏死因子（TNF-α）或氧化的LDL（氧化低密度脂蛋白）的减少导致内皮蛋白质亚硝基化。 尽管当前NO生物活性降低与高血糖与糖尿病相关的血管内皮功能障碍和血管损伤作用的分子机制仍不清楚。本文描述了在内皮细胞中S-亚硝基化的蛋白质是否受高糖影响，同时研究了S-亚硝基化蛋白潜在调控蛋白机制在特定环境的影响。 研究设计与方法 细胞培养和试剂 通过生物素转化实验检测S-亚硝基化的?蛋白质 S-亚硝基化蛋白免疫组化染色 质谱分析 荧光原位DNA结合测定法检测NF-κB活化 统计学分析 结果 高糖减少了S-亚硝基化的??蛋白质在HUVECs中的含量； 谷胱甘肽影响高糖诱导蛋白质S-亚硝基化的减少； 高糖诱导减少S-亚硝基化??蛋白质； ROS抑制剂可以逆转高糖S-亚硝基化； 高糖影响NF-κB S-亚硝基化和激活。 讨论 在本研究中，我们第一次高糖能够衰减在原代人类蛋白质S-亚硝基化的整体水平。我们已经确定了至少7蛋白质高血糖它们的S-亚硝基化的状态，如图和表1。这些下降的S-亚硝基化蛋白可以被归类为1）骨架蛋白（肌动蛋白，桩蛋白和波形蛋白，纽蛋白），2）代谢酶（eNOS和二酰基甘油激酶），3）分子伴侣（GRP78），4）信号分子（H-ras和ERK-1），和5）转录因子（NF-κB）。高糖条件下虽然绝大多数的S-亚硝基化的??蛋白水平下降，其中一些程度实际上是增加或不变的，提示高糖亚硝基化蛋白质角色。因为S-亚硝基化的调节牵连大量的蛋白质活，结果，高血糖调节内皮细胞中蛋白质S-亚硝基化??提供了新的潜在高血糖对脉管损伤100多个蛋白质已被确定为S-亚硝基化的??，而调节磺化-亚硝基化仍不清楚。在内皮细胞中亚硝基化的降低促炎介质TNF和ox LD和增加细胞切应力。内皮细胞和ox LD诱导超氧释放，而切应力增加，如超氧化物歧化酶，抗氧化剂分子的表达，提高细胞内谷胱甘肽和NO水平降低氧化应激。任何给定的靶蛋S-亚硝基化被认为是由形成生物相关的硝基化硝基化