生物化学实验讲义-正式-1.docVIP

生物化学实验讲义 化学与环境工程学院 化学与环境实验教学中心 2011-09-01 目 录 生物化学实验室规则 3 实验一 氨基酸的分离鉴定—纸层析法 4 实验二、乳中酪蛋白的分离 6 实验三 蛋白质等电点测定和沉淀反应 7 实验四 蛋白质的定量测定 11 实验五 植物叶片中过氧化脂质含量的变化 13 实验六 植物过氧化酶活性的测定 14 生物化学实验室规则 1 每个同学都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声谈笑。 2 实验前必须认真预习，熟悉本次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。 3 实验过程中要听从教员的指导，严肃认真地按操作规程进行实验，并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本上，文字要简练、准确。完成实验后经教员检查签字同意，方可离开实验实。 4实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐。公用试剂用毕，应立即盖严放回原处。勿使试剂、药品洒在实验台面和地上。实验完毕，仪器洗净放好，将实验台面抹拭干净，才能离开实验室。 5使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约。洗涤和使用仪器时，应小心仔细，防止损坏仪器。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障须立即报告教员，不得擅自动手检修。 6 实验室内严禁吸烟！注意水电安全，离开实验室前，必须关好水龙头，拉下电闸，严防发生事故！ 7 废液倒入专门的废液桶，固体废物和带残渣的废物不得倒入水槽或到处乱扔。 8 仪器损坏时，应如实向教员报告，并填写损坏仪器登记表，然后补领。 9 实验室内一切物品，未经本室负责教员批准，严禁携出室外，借物必须办理登记手续。 10每次实验课由班长负责安排值日生。值日生的职责是负责当天实验室的安全、卫生和一切服务性的工作。 实验一 氨基酸的分离鉴定—纸层析法 一、实验目的 1. 学习纸层析法的基本原理和操作技术 2. 掌握氨基酸Rf值的计算方法 3. 掌握通过已知氨基酸对未知氨基酸和未知混合氨基酸组分进行鉴定 二、实验原理 层析法又称色层分析法，根据支持物的不同分为吸附层析、离子交换层析、分配层析。纸层析是常用的、经典的分配层析技术，支持物是滤纸，固定相是水，流动相为有机溶剂。 将样品点在滤纸上（这点称为原点），用扩展剂进行展层时，样品中各种的溶质即在两相溶剂中不断的进行分配，由于个溶质在两相溶剂中的分配系数a（a=溶质在流动相中的溶解度/溶质在固定相中的溶解度）不同，因而不同溶质随流动相移动的速率不等，从而将其分离开来行程距离不等的层析点。 溶质在滤纸上的位置可用比移值（Rf）表示： Rf=原点到层析点中心的距离/原点到扩展剂前沿的距离 对同一溶质来说，层析条件不变Rf是一常数，所以可以利用溶质的Rf值做出定性分析。根据Rf值可以用已知氨基酸鉴别未知氨基酸和混合氨基酸的组分。 三、实验材料、试剂和仪器 1. 材料、试剂 （1） 扩展剂 将20ml正丁醇和5ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15ml水混合，充分震荡，静置后分层，放出下层水层。将漏斗内的扩展液放入磨口瓶中备用。 （2） 氨基酸溶液：0.5%赖氨酸；0.5%脯氨酸；0.5%缬氨酸；赖氨酸、缬氨酸、脯氨酸混合溶液各组分的浓度均为0.5%。 （3） 显色剂：0.1%水和印三酮正丁醇溶液（0.1g印三酮溶于100ml水饱和正丁醇溶液） 2. 仪器：培养皿；滤纸；表面皿；毛细管；喷雾器 四、操作步骤 1. 取直径12.5cm圆形滤纸一张，用铅笔过圆心作两条相互垂直的线，在每条线上距圆心0.5cm处做标记（画一个点）并分别在其边缘上标上赖、脯、缬、混等字样。 2. 用毛细管分别蘸取测定液各一滴，在滤纸的样应点样。等一次点样干了之后再点一次，重复2—3次，点样直径不超过3mm。 3. 用小枪头或其它在滤纸圆心扎一小孔，另取滤纸将其卷成筒状，捻紧如灯芯，底部用剪刀剪成碎条状，从滤纸的点样背面插入小孔，突出滤纸面约0.5cm。 4. 在表面皿中加入约3ml扩展液，再将其放入培养皿正中，将滤纸平放在培养皿上，使滤纸芯浸入到扩展液中，盖上培养皿，待扩展剂距边缘1cm时，即可取出停止层析。用铅笔画出扩展液前沿后，吹干或烘干。 5. 将滤纸平放在表面皿上，喷雾0.1%水和印三酮正丁醇溶液再吹干或烘干，观察层析出现的弧形紫色斑。用铅笔标出原点到层析点中心的距离和到扩展液前沿的距离，计算Rf值。 实验二、乳中酪蛋白的分离 一、实验目的 掌握从乳中制备酪蛋白的原理和方法 二、实验原理 酪蛋白是乳中存在的主要蛋白质，含量约为35g/l，酪蛋白不是一种简单的蛋白质，而是一些含磷蛋白质的混合物。 在某一pH值下，氨基酸分子所带正负电荷相等，本身呈电中性。这时溶液的pH值称为氨基酸的等