食品生物技术实验指导书2012.docVIP

食品生物技术实验指导 何志平 等编 农业与食品科学学院 20012.10 实验一 质粒DNA的提取及电泳检测 一 实验目的 通过本实验学习掌握碱裂解法提取细菌质粒DNA。 二 实验原理 1. 细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。 2. 质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法，煮沸法，去污剂（如Triton和SDS）裂解法。3. 碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状DNA由 于空间缠绕，两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。 三 实验材料：转化后的细菌(含有质粒的大肠杆菌) 四、实验用具和药品 1. 实验用具: 摇床，离心机，移液器及枪头，玻璃试管（15mL）及塞子，离心管（1.5mL） 2. 实验试剂： 1 溶液I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl（pH8.0） 10 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0） 2 溶液II 0.4mol/L NaOH，2%SDS，用前等体积混合 3 溶液III 5 mol/L 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 4 TE 缓冲液 10 mmol/L Tris·HCl（pH8.0） 1 mmol/L EDTA（pH8.0） 5 70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回） 6 RNA酶 将RNA酶溶于10 mmol/L Tris·HCl（pH7.5）、15 mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。 7 加样缓冲液（6X）：40%蔗糖、0.25%溴酚兰 电泳缓冲液：0.045mol/L Tris-硼酸? ?0.001mol/L EDTA （0.5X TBE buffer） 贮存液： 5X：54g Tris碱? ? 27.5g硼酸? ? 20ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 五 实验步骤 （一）细菌繁殖 挑取白色的单菌落若干，转移到3mL液体LB培养基(附加100mg/ml Amp ),37℃过夜振荡（200r/min）培养。 （二）菌体收集 将过夜培养的菌体转入1.5mL离心管，离心30sec 5000r/min；弃上清提取质粒 （三）质粒提取 方法一：碱裂解法提取质粒DNA 1．.将上述沉淀重悬于μL冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈震荡； 2．加入μL溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5~10次； 3．加入μL冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，温和地颠倒离心管5~10次；9000r/min离心5min上清转移到另一新1.5mL离心管中； 4．加等体积氯仿，振荡混合，静置， 9000r/min离心5min，上清转移到另一新1.5mL离心管中； 5．加入1/10体积3mol/L的醋酸钠和2倍体积的乙醇，充分混匀，静置5min；9000r/min离心5min； 6．弃上清，用70％ethanol洗涤； 7．加30μLTE溶解，-20 ℃保存。 方法二：试剂盒提取方法 1.离心收集的菌体中加入含RNAase的溶液Ⅰ250μL，重悬菌体； 2. 加溶液Ⅱ250μL，轻轻颠倒离心管~10次，静止（1-2分钟），至溶液澄清； 3. 加入350μL冰预冷的溶液Ⅲ，快速颠,20-30次； 4. 12000r/min离心10min； 5. 将上清转移到DNA结合离心管中，12000r/min离心1min； 6. 加入去蛋白试剂500μL，12000r/min离心1min； 7. 加洗涤液750μL，12000r/min离心1min； 8. 加洗涤液700μL，12000r/min离心1min； 9. DNA结合柱12000r/min离心2min，去除残余的洗涤液； 10 DNA结合柱放入另一个新的1.5mL离心管中，室温1-2min，加入洗脱缓冲液50-100μL； 11 12000r/min离心1min； （四）检测提取DNA质量的电泳检测。 取2ul质粒DNA+2ul加样缓冲液+6ul ddH2O； 配制1%的琼脂糖凝胶 电泳30min，EB染色，拍照。 注意事项：氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、口罩。 六 实验作业 1. 思考本实验的关键步骤是什么？ 2. 琼脂糖电泳鉴定质粒DNA时，能看到几条带，快慢顺序是什么？ 3. 附上电泳图片