质粒的手工大量提取（实验室适应版）.docVIP

物品准备 3 M 醋酸钠: NaOAC.3H2O，40.8 g置于200ml烧杯中；加入40ml去离子水搅拌溶解；冰醋酸调节Ph至5.2；加去离子水到100ml，高压灭菌，室温保存。 Solution I： 配成含50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·HC1(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)。 1 M Tris-HCL (Ph 8.0) 25 ml,0.5 M EDTA(Ph 8.0) 20 ml,20% Glucose(1.11M) 45 ml,dH2O 910 ml。高压灭菌，4℃保存，使用前每50ml Solution I中加2ml的RNase A(20mg/ML)。使其终浓度为100 ug/ml。 Solution II： 临用前用0.4mol/L NaOH(用10mol/L的NaOH贮存液现用现稀释)，2％SDS(用10％的SDS贮存液现用现稀释)等体积混合。 或者：10% SDS 50 ML（终浓度1%,W/V），2 N NaOH 50 ML（终浓度200Mm），使用无菌水定容到500 ML，室温保存，有效期一个月。 Solution III： 5mol/L乙酸钾60.0ml，冰醋酸11.5ml，水28.5ml，过滤消毒。 或者：乙酸钾，147g(终浓度3mol/L)，冰醋酸（57.5 ml）(终浓度5M)，定容至500ml,高压灭菌，4℃保存。 10mg/ml RNase: 将10mg的RNase溶解于1ml的含10mmol/L Tris·Cl(pH7.5)，15mmol NaCl溶液，100℃加热15min，室温冷却，分装后-20℃保存。 STET: 配制成10mmol/L Tris-CL(Ph 8.0),0.1 mol/L NaCL, 1 mmol/L EDTA (Ph 8.0),5%(V/V)Triton X-100。配制后确保PH值为8.0，不需灭菌。 5mol/L LiCl： 21.2 g LiCl溶解于去离子H2O并定容至100 ml，高压灭菌。 TER： 即含20μg/ml RNase的TE 1.6 mol/L NaCl[含13%PEG8000(W∶V)]： 碱裂解法大量提取质粒DNA并用PEG进行纯化（200ml,如加量则相应增加） (1)挑取单菌落接种于5ml含Amp的LB液体培养基中，37℃培养8～12小时。 (2)取上述新鲜培养物小提质粒鉴定后，剩余的菌液接种于含Amp的200ml LB培养基中，37℃培养12～16小时至OD600约0.6。 (3)用50ml离心筒收集菌液（40ml×5×3），4℃、5,000 rpm离心10分钟，弃上清。 (4)用 8 ml×15预冷的STE重悬菌体，并将各自的菌归为一管，5,000rpm离心5分钟，弃上清。 (5)用4ml预冷的溶液I重悬菌体，加入8ml新鲜配制的溶液II，轻轻颠倒混匀；再加入6ml预冷的溶液III，轻轻颠倒混匀,冰浴10分钟。 (6)4℃、15,000rpm离心20分钟，将上清转移至另外的50ml管中。 (7)加0.6倍体积的异丙醇(18×0.6=10.8 ml)，颠倒混匀，室温放置10分钟。 (8)室温下、12,000rpm离心15分钟，弃上清，70%乙醇洗涤沉淀，37℃蒸发至沉淀边缘透明。 (9)加入3ml TE使DNA溶解后，转移至10ml的离心管,进一步用PEG法纯化质粒。 (10)加入等体积5mol/L的LiCl溶液(3ml)，轻轻混匀，-20℃放置5～10分钟。 (11)将液体分成(1ml×6×3), 4℃、12,000rpm离心15分钟，转移上清至另一1.5ml的离心管，加入等体积的异丙醇，混匀,-20℃放置20分钟以上。 (12)室温下、12,000rpm离心15分钟，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，倒置控干后，37℃蒸发至沉淀基本透明。 (13)加入83.3μl TER(即含20μg/ml RNase的TE)溶解，并消化RNA一小时。 (14) 将对应的质粒合并到一个1.5mlEp管中（约500ul），加入500μl 1.6 mol/L NaCl[含13%PEG(W∶V)]，混匀后置冰上(其时间可放置很长)。 (15)4℃、12,000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶于600μl TE中。 (16)用等体积的酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次(10,000rpm离心5分钟)。 (17)各分为4管，上清转移至另一1.5ml Ep管，加入2倍体积的无水乙醇以及3mol/L NaAC使其终浓度为0.3mol/L，冰上放置15分钟。 (18)4℃、12,000rpm离心10分钟，弃上清，加入75%乙醇进行漂洗。 (19)12,000rpm离心5分钟，弃上清，倒置干燥5分钟。 (20)根据沉淀的多