第二章生物化学.ppt

基本原理 制备蛋白质 制备核酸 根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。 中性盐沉淀（盐析法）:多用于蛋白质和酶 有机溶剂沉淀：多用于核酸，也用于蛋白质 选择性沉淀：热变性及酸碱变性沉淀法 非离子多聚物沉淀法：聚乙二醇，用于生物大分子 第二节 制备蛋白质 盐析法 有机溶剂法 选择性沉淀法 聚乙二醇沉淀法 一、盐析法 概念：在溶液中加入大量的中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。 基本原理：中性盐夺走水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域；同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体； 分级沉淀：调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如： 2、盐析突出的优点 ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 ②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。 ? 3.影响盐析的因素 蛋白浓度：高浓度的蛋白质，可以节约盐的用量，但蛋白质浓度过高，会发生严重的共沉淀作用。在低浓度的蛋白质溶液中盐析，用盐量较多，共沉淀少。一般2.5%-3.0%的蛋白质浓度较适中。 离子强度：一般，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在分离时，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。 影响盐析的因素 pH 值：为提高盐析效率，多将溶液pH调制目的蛋白的等电点处。注意：蛋白质的等电点在水中或稀盐溶液中与高浓度下测的结果不同。根据实际情况调整 温度：在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。 在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。 4、盐的选择 负离子带电荷较多者，盐析能力较强，如硫酸钠的盐析能力大于氯化钠。正离子带电荷较多者，盐折能力较低，如硫酸镁的盐析能力小于硫酸铵。 盐的选用还要考虑盐的溶解度，如果溶解度低，在溶液中不能达到高浓度，其应用就会受到限制。 常用的中性盐是硫酸铵 优点：① 溶解度大：（NH4）2SO4在0℃时仍有70.6％的溶解度，远远高于其它盐类。 ② 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。 ③ 有稳定酶与蛋白质结构的作用。 ④ 价格便宜，废液不污染环境。 缺点：需脱盐 硫酸铵溶液饱和度计算 固体法 g= g表示在一升溶液中需加入固体硫酸铵的克数；S2：表示要达到的百分饱和度，S1表示原溶液中的百分饱和度。 硫酸铵溶液饱和度计算表（表2-2）p25 饱和溶液法 盐析曲线制作p26 若生物材料来源容易，主要考虑提高纯化倍数时，选择48%-65%盐饱和分级范围，则纯化倍数可达3.0，而收得率仅为75%。 若生物材料来源困难，主要考虑提高收得率时，则选择45%-75%盐饱和分级范围,则收得率可达80%，而纯化倍数将小于2.4。 4、脱盐 透析法：将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。 透析法 透析 透析袋的选择与处理： 透析液的选择：低离子强度的中性缓冲液。对含辅基的酶透析时，在透析液中宜加入适量的辅基或保护辅基的试剂。 透析时间：搅拌情况下，样品液与透析体积之比宜1：10，3小时可达平衡。 静止状态进行时，样品液与透析体积之比宜1：20，过夜。 脱盐是否彻底，要经常检查。 二、有机溶剂沉淀法 基本原理：一方面，与盐溶液一样有脱水作用。 另一方面，能降低溶液的介电常数。 溶剂的极性与其介电常数密切相关，极性越大，介电常数越大，如20℃时水的介电常数为80，而乙醇和丙酮的介电常数分别是24和21.4，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。 有机溶剂沉淀法 优点：①分辨能力比盐析法高 ②沉淀不用脱盐，过滤比较容易。 缺点：对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活。 有机溶剂沉淀法 有机溶剂的选择： 首先是要能与水互溶。 沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。 沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是乙醇。 三、选择性沉淀法 1）利用表面活性剂(三氯乙酸)或有机溶剂引起变性； 2）利用对热的不稳定性,加热破坏某些组分，而保存另一些组分； 3）酸碱变性。 例如：从酵母菌细胞中纯化醇脱氢酶 采用了改变温