黄瓜总DNA的提取及鉴定.docVIP

黄瓜总DNA的提取及鉴定 (武汉生物工程学院 园本一班 实验组：熊冰峰，陈家定） 摘要:植物DNA首先要在液氮或干冰中将新鲜或冷冻的植物组织研磨成粉，使细胞壁破碎，再用含有去污剂、螯合EDTA等成分的提取缓冲液处理组织匀浆。用氯仿-异戊醇把组织匀浆中变性的蛋白质除去，将DNA与细胞中的蛋白质、碳水化合物等分开；再用RNase A去除核酸中的RNA,剩下的便是DNA。DNA可用乙醇或异丙醇沉淀，沉淀的DNA可用挑取或离心方法收集。DNA的纯度可用紫外分光光度计做初略测量。核酸、蛋白质、盐与小分子的最大吸收峰值分别为260nm、280nm及230nm。顺序测定一个样品在这三种波长下的OD值，如果提取的样品较纯，蛋白质及小分子的污染较小，则OD/OD1.8，OD/OD2.0。通过测定OD，根据公式（双链）的浓度（ug/m L)。DNA的完整性可用凝胶电泳来测定。常用的凝胶有聚丙烯酰胺与琼脂糖。琼脂糖电泳可分理相差100bp的DNA片段，但分离范围大，制备简单。 方法：植物组织（削皮的黄瓜）在液氮中研磨，磨好的组织溶于65℃ CTAB提取缓冲液中，保温一段时间后用酚-氯仿抽取2次，除去变性的蛋白及大部分碳水化合物。再用乙醇将DNA沉淀下来。获得的DNA用紫外分光光度计测定浓度及纯度，再用琼脂糖凝胶电泳检测完整性。 关键词：DNA，提取及鉴定 实验材料与方法 1.1实验材料 黄瓜 1.1.1试剂 液氮； CTAB提取缓冲液； TE缓冲液或重蒸水； 酚：氯仿：异戊醇=25：24:1； 异丙醇或无水乙醇； TE缓冲液，重蒸水； 0.3%(m/V）标准琼脂糖； 0.5×TBE缓冲液，上样缓冲液； EB； 1.1.2器具 研钵，小药勺； 1.5 m L小离心管若干； 定量移液器及枪头； 离心机； 恒温水浴锅； 紫外分光光度计； 水平电泳槽； 三角瓶（500或1000mL)； 微波炉或沸水浴，透射紫外灯 1.1.3生物材料 黄瓜 1.2试验方法 1.2.1 提取DNA CTAB于65℃，水浴30min。 称取8g(黄瓜去皮）研磨破碎细胞壁。 加20 mol CTAB于研磨中混匀酚浆，2支离心管于65℃水浴15min ，3500 Hpm，5min去除残渣。 取上清液5mL于离心管中，加入5mL氯仿-异戊醇上下颠倒混合2 min 上清液转移至小烧杯中加2倍体积预冷的乙醇，观察纤维状沉淀。 转移10mol离心管中，4℃水箱保存备用 1.2.2 DNA浓度及纯度的测定 将提取的DNA粗产物离心3500 rmp，10 min。 弃上清液，加约5mL70% 乙醇吹打洗涤，使沉淀悬浮。 3500 rmp,10min使DNA沉淀。 弃上清，2支离心管：一支加5mL氯化钠水溶液溶解；另一支4℃保存下次备用 用氯化钠作对照基线校正后沉淀220-350nm的光谱图。 用氯化钠作空白对照，测定OD、 OD、OD。 1.2.3 琼脂糖凝胶电泳 制胶：称取0.25g琼脂糖溶解在25mL1×TBE中微波炉加热，微沸3次冷却至60℃倒胶。 点样：待胶冷却凝固后，将DNA样品加2mlddHO溶解，取10ml与3ml loading buffe混合，并用移液枪小心加入至样品槽中 电泳：点样端放在负极。120V，40 min 凝胶成像， EB染胶10min，流水5min，凝胶成像在系统下观察。 结果与分析 2.1 提取DNA 提取出黄瓜的DNA。 2.2 DNA浓度及纯度的测定 记录220-350nm时的光谱图 计算 OD/OD，OD/OD，分析DNA的纯度 OD= DNA的浓度=50×OD×稀释倍数= 波长换成280nm及230nm,用同一样品再次测OD的值： OD = ； OD= OD/OD= ； OD/OD= 则提取DNA的纯度 2.3 琼脂糖凝胶电泳 观察并分析DNA的电泳图像 从图中可以看出，如果基因组DNA完整，应该仅出现一条主带； 如果很多条深浅不一的带，则说明DNA已经降解； 如果背景模糊，说明在DNA样品中混杂有RNA； 3.1 提取DNA CTAB提取液中各试剂分别的作用？ 细胞膜裂解，使DNA释放到提取缓冲液中，同时使组织匀浆中的蛋白质变性；缓冲液中的-疏基乙醇，-疏基乙醇抑制从组织匀浆释放的多酚氧化，防止植物组织黄褐变。 3.3 琼脂糖凝胶电泳 影响DNA电泳速率有哪些因素？ DNA片段的长度； DNA的构象； 琼脂糖的浓度； 电压 电泳的原理：带电物质在电场中向着与共电荷相反的电极移动DNA分子在高于PI的溶液中带负电荷在电场中向阳极移动。 琼脂糖的作用：使DNA分离开琼脂糖凝胶的口径越大，能被分离的DNA越大。