淀粉酶的专一性和温度、pH、激活剂.docVIP

实验九 淀粉酶的专一性和温度、pH、激活剂 及抑制剂对酶活性的影响 实验类型：验证型 目的和要求 1.通过本实验观察、验证酶的专一性和温度、pH、激动剂及抑制剂对酶活性的影响。 2.熟悉淀粉及其酶解产物的特殊显色方法；电热恒温水浴的使用。 3.了解唾液淀粉酶的收集与预处理。 原理 酶具有高度专一性，一种酶只能催化一种或一类底物发生反应，如淀粉酶只能水解淀粉，不能水解蔗糖。当淀粉被淀粉酶彻底水解为还原性麦芽糖和葡萄糖时，能使班氏试剂的Cu2+还原成Cu1+，生成砖红色Cu2O沉淀。淀粉酶的活性受温度、pH、激动剂及抑制剂、酶浓度以及作用时间等多种因素影响，因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。不同程度的水解糊精可与碘反应生成紫色、棕色或红色络合物。通过上述特征性反应，并以蔗糖等作对照，便可观察、验证淀粉酶是否具有专一性以及它的催化活性是否受到影响。 操作方法 一、唾液淀粉酶的收集与处理 1.制备唾液实验者先将痰咳尽，用自来水漱口，以清除口腔内食物残渣，再在口腔内含蒸馏水约15ml，并作咀嚼咕漱运动，3分钟后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱布的漏斗内，过滤于小烧杯中备用，为与下面稀释唾液相区别，此称制备唾液。2.煮沸唾液取上述唾液约2ml，盛入1中号试管中,置沸水浴煮沸5分钟备用。3.稀释唾液调整唾液淀粉酶活性，使之在pH6.8、37℃和既无激动剂又无抑制剂条件下，作用5min，水解淀粉至红色糊精为宜。具体做法是取12凹白瓷反应板一块，按下列步骤操作：①第1排每凹各加1滴制备唾液，12、13、14凹分别加生理盐水1、2、3滴，用滴管采用抽吸法，由稀到浓（14→12）小心混匀各凹，勿使溅入相邻凹中。每混匀一凹便取其1滴放入同列的2排凹中，剩余稀释唾液应全部放回原凹中。②在盛有不同稀释度唾液的第2排各凹中，均加入4滴缓冲液（pH6.8），2滴1%的淀粉液和2滴蒸馏水，用①混匀法充分混匀，置37℃下5min。③在第2排各凹中加I液一滴，混匀，观察比较各凹颜色，以浅棕-红色对应的稀释倍数，用生理盐水稀释3ml制备唾液备用。 二、唾液淀粉酶的专一性以及温度、pH、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活性影响的观察 （一）取试管3支编号，按下表1操作 表1? 唾液淀粉酶专一性的实验观察 ??? 试剂?? 试管 pH6.8缓冲液 1％淀粉溶液 1％蔗糖溶液 制备唾液 煮沸唾液 1 20滴 10滴 － 5滴 － 2 20滴 10滴 － － 5滴 3 20滴 － 10滴 5滴 － 　将上述各管混匀后，置37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入班氏试剂20滴，再放入沸水浴中煮沸约15分钟，观察各管颜色反应，并说明原因。 （二）温度影响酶促反应的实验观察 1.取试管3支编号，按下表2操作： 表2? 温度影响酶促反应的实验观察 管号 试剂 1 2 3 1.pH6.8缓冲液 20滴 20滴 20滴 2.1％淀粉溶液 10滴 10滴 10滴 3.预热5min 37℃水浴 沸水浴 冰浴 4.直接加入稀释唾液，立即混匀、计时 5滴 5滴 5滴 5.保温10min 37℃水浴 沸水浴 冰浴 　2.将一、二管移入冰水浴中，待各管温度一致后速向各管加入碘液1滴，混匀后观察各管颜色的区别，并说明温度对酶促反应的影响。 四、pH影响酶促反应的实验观察 1. 取试管3支编号，按下表3操作： 表3? pH影响酶促反应的实验观察 ? pH4.0缓冲液 pH6.8缓冲液 pH8.0缓冲液 1％淀粉溶液 稀释唾液 试管1 20滴 － － 10滴 5滴 试管2 － 20滴 － 10滴 5滴 试管3 － － 20滴 10滴 5滴 　2.将上述各管混匀后，置37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入碘液1滴，混匀后观察各管颜色的区别，并说明pH对酶促反应的影响。 五、激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察 1. 取试管4支编号，按下操作： 表4? 激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察 ? pH 6.8 缓冲液 1％淀粉溶液 蒸馏水 0.9％NaCl 1％ CuSO4 1％Na2SO4 稀释唾液 1 20滴 10滴 10滴 － － － 5滴 2 20滴 10滴 － 10滴 － － 5滴 3 20滴 10滴 － － 10滴 － 5滴 4 20滴 10滴 － － － 10滴 5滴 　2. 将上述各管放入37℃水浴中保温10分钟怎么减肚子，然后每管加入碘液1滴，混匀后观各管颜色的区别，并说明激动剂和抑制剂对酶促反应的影响。 注意事项 1.反应试管应清洗干净，不同酶液、试剂及其滴管不能交叉混用； 2.使用混合唾液，或通过预试选出合适的唾液稀释度，效果更为显著。 试剂和器材 一、器材 1.滴管、烧杯、试管（架）及试管夹 。 2.恒温水浴箱与水浴锅。