酪氨酸酶催化氧化对位取代苯酚及其生物学意义.docVIP

酪氨酸酶催化氧化对位取代苯酚及其生物学意义 庞朝乐 徐迪 马林* (中山大学化学与化学工程学院，广州，510275) 摘要 在有苯胺的存在下，酪氨酸酶催化对苄氧基苯酚，发生氧化－迈克尔加成反应，得到4,5-二苯胺基-2-苯亚胺基-环己-3,5-二烯酮，证明苄氧基被亲核试剂取代，从苯环上脱落。因此，我们利用布洛芬和对苯二酚反应制成药物前体模型化合物。在有邻氨基苯甲醚的存在下，酪氨酸酶催化氧化该模型化合物的氧化－迈克尔加成反应，从而释放出药物。高效液相表明，反应得到成功。 关键词 酪氨酸酶，布洛芬，氧化－迈克尔加成，药物前体 酪氨酸酶（Tyrosinase），又称多酚氧化酶，儿茶酚氧化酶（Ec.1.14.18.1），它广泛存在于植物、动物、和微生物中。酪氨酸酶具有加氧酶和脱氢酶两种活性，能催化单酚类化合物选择性的羟基化生成邻苯二酚，在酪氨酸酶作用下邻苯二酚又继续氧化脱氢生成邻苯醌。根据酪氨酸酶催化黑色素合成的机制[1]，酪氨酸酶催化酚类化合物的氧化形成的邻醌,在亲核试剂存在下，可以继续发生迈克尔加成反应。这种氧化－迈克尔加成反应的存在很可能是酚类化合物具有毒性的原因，也可能是儿茶酚类化合物具有抗癌活性的原因[2]。 在醌和胺的迈克尔亲核加成反应中，醌上的取代基被胺取代的反应在对醌中很常见，而在邻醌中很少有报道。只有在1971年，W.M.Horspool和P.I.Smith曾报道了在4位上有烷基取代的邻苯醌化合物在亲核试剂芳香胺的进攻下，不仅发生迈克尔加成反应，而且4位上的烷基也被芳香胺取代[3-4]。在这里我们研究采用酪氨酸酶为催化剂，催化对苄氧基苯酚的氧化反应得到相应的4取代邻苯醌，而这邻苯醌类化合物是否又能和芳香胺发生的类似反应，使苄氧基从苯环上脱落。如果这个反应能够成功，我们是否又可以根据单酚上的取代基在酶和胺作用下被胺取代这一反应机理，设计相应的药物前体模型化合物，对这一反应机制在药物设计和合成上的应用进行了初步的探讨。 实验部分 1.1 仪器和试剂 核磁共振仪（JEOL－FX90Q型）；质谱仪（VG ZAB-HS型）；元素分析仪（德国Elementar 公司VerioEL元素分析仪）；红外光谱仪（Vector 22 FT－IR型）；高效液相色谱（HP 1100型）；组织匀浆器；旋转蒸发仪。 酪氨酸酶（从土豆中提取）；布洛芬（构于药厂）；层析用硅胶。 石油醚；乙酸乙酯；丙酮；氯仿；二氯亚砜；苯胺；三乙胺；邻氨基苯甲醚（以上试剂均为分析纯，构于广州化学试剂厂）；对苯二酚；对苄氧基苯酚（SIGMA公司） 1.2 酪氨酸酶的提取 将约500克选好的新鲜的土豆洗净并切成小块，加入500mLpH6.0的0.1mol/L的K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液，加入少量抗坏血酸，用组织匀浆器搅拌3-5分钟，然后用6层的纱布过滤，滤液静置于冰箱中0℃下5分钟，到出上层清液，在剧烈搅拌下缓慢加入500mL的冰冷丙酮，继续搅拌15分钟，再放置冰箱中冷冻2小时，抽滤，得到2.0～2.5克的灰黄色的粗酶，放置于冰箱中冷冻，备用。 1.3 酪氨酸酶的固定化 把20 克硅藻土浸泡在10％的盐酸-甲醇溶液中2小时，用蒸馏水洗至pH7.0，然后在110℃活化备用。取1.50克粗酶用10mL，0.1mol、pH6.0的K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液溶解，加入4.0克硅藻土，拌至粘稠状，放置过夜风干。 1.4 酪氨酸酶催化氧化对苄氧基苯酚和苯胺的氧化加成反应 把3.0克固定化酶转移到150ml锥形瓶中，加入0.5克（0.0025mol）对苯氧基苯酚，拌匀，然后加入75ml氯仿，于室温下振荡20小时，除去氯仿，得粗产品。把粗产品与0.75克（0.0081mol）的苯胺混合在20mL乙醇中反应半小时，再加入80mL水溶液搅拌过夜，抽滤，得到产品0.5克。用200-300目硅胶柱和环己烷:二氯甲烷=1:1的溶液过柱洗脱，得到0.3克(30.2%)棕红色针状晶体(scheme1)。分子式， C24H19N3O； mp,209-210℃, FAB-MS:m/z, 366(M+1).IR(KBr):3264,3054,1632,1577,1505,1505,1443,1367,1342,1294,1242,1175, 754,695,523cm-1。 1HNMR（丙酮,500MHZ）δ6.00(1H,s,C=C-H),6.20(1H,s,C=C-H), 7.0-7.5(15H,m,Ph-H), 8.00(1H,s,N-H)，8.90 (1H,s,N-H )。 scheme 1 1.5 酪氨酸酶催化布洛芬药物前体模型化合物与