高效力高选择性的Ro激酶抑制剂的发现.docVIP

高效力高选择性的Rho激酶抑制剂的发现 院系：生命科学学院 专业：生物技术 学号：0570166 姓名：王晨瑜 在Rho GTP酶家族中，Rho关联的含交织螺旋的蛋白激酶（ROCK）是研究得最为深入的效应子之一。Rho GTP酶家族是Ras GTP酶超家族的一个亚族，它就像一台“分子装置”，当GDP与之结合时失活，当GTP与之结合时激活，通过这种机制精确调控各条复杂的信号通路1。当GTP酶处于激活状态时能激活许多下游的效应子，ROCK就是其中之一。ROCK是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，分子量约为160kDa2，该酶有两个亚型——ROCK-I和ROCK-II3，它们的相似性在氨基酸水平上达65％，在蛋白结构域上达92％4。ROCK被激活后所产生的病理生理结果是极其复杂的，该酶在平滑肌的收缩、神经轴突生长的回缩等生理活动中都起着重要的作用；在许多中枢神经系统紊乱疾病中也可以观察到ROCK的异常激活。所以，抑制ROCK的活性是治疗由上述系统错乱所致疾病的有效途径，如青光眼、高血压、阴茎勃起功能障碍、哮喘、动脉粥样硬化、中风、癌症等。 目前见诸文献的ROCK抑制剂大都含有异喹啉、吡啶、吲唑等基团，这些化合物要么在ROCK生化分析时效力平平，要么细胞活性较差。最近又有文献报道了一类具有发展前景的新型ROCK抑制剂（ROCK-I抑制剂），其结构是以氨基呋咱-阿扎苯并咪唑为骨架。在这一新类中，有些化合物的细胞分析IC50值已经低于100nM。 本论文作者的目标是发现一种高效力的ROCK抑制剂（ROCK-II抑制剂），它的生化分析IC50值要低于10nM，细胞分析IC50值要低于100nM；而且，该抑制剂要有高选择性，亦即其对于其他激酶、非激酶酶和受体的IC50值要高于1μM。作者所在实验室于2006年（论文发表于2008年）通过高通量筛选的方法发现了一个化合物1——以吡啶-噻唑为母核的酰胺化合物5，这是一种基于筛选途径的药物发现方式，所谓高通量筛选是指一种运用计算机控制的高敏化和专一性筛选模式，它能够对大量化合物的药效进行微量样品的自动化检测，筛选样品一天可达几十万个，命中率约0.01％，大大加速了新药的寻找和发现过程（仇缀百：药物设计学（第2版），高等教育出版社，2008年，第17页，下文标页码处均引自本书）。虽然1是一种高效力的ROCK-II抑制剂，且选择性也较高，但肌球蛋白轻链双磷酸化（ppMLC）测试中其IC50值有相对较大的上调。作为一种先导化合物，往往存在选择性不够、作用强度较弱、药动学性质不佳或有毒副作用等问题而不能直接用于临床（第213页），所以，作者对1进行了优化：将其中的噻唑环用苯环来取代，结果有点出乎意料，ROCK-II IC50值和ppMLC IC50值都升高了（也就是说，该化合物的效力和选择性都降低了）。作者对此结果的解释是：可能是2中的吡啶-苯环系统破坏了1中吡啶-噻唑所形成的最佳几何构型。在中心苯环上接一个含氮五元杂环也许可以模拟1中的吡啶-噻唑结构，所以作者合成了3，与2相比，吡唑环取代了吡啶环的位置。 通过测定ROCK-II IC50值和ppMLC IC50值发现含有吡唑-苯环骨架的3的效力比1还要强。在中心芳环上引入取代基可以改善该药物的整体药剂学性质和/或增强它的选择性。因此，作者合成了4，这一甲氧基取代的化合物表现出了更高的选择性和更强的细胞效力。然而，令人遗憾的是，4对于MRCK（与ROCK关系最密切的激酶）的选择性却下降了。为了弥补这一缺憾，作者合成了5，引入双甲氨乙氧基团来取代4中的甲氧基，测试结果显示，无论是用生化分析还是用细胞分析，5的效力都是相当强的，对于所有被测酶类的选择性也是相当高的，更令人可喜的是，该化合物对于ROCK-I的IC50值高达56±12nM，充分显示了它对于ROCK-II的高选择性（ROCK-II IC50=3.2±2.3nM）。这样，一类新型的ROCK抑制剂（ROCK-II型抑制剂）就诞生了。需要指出的是，这五种化合物都是外消旋体，各个对映异构体的性质正在研究中。 作者还介绍了5的合成路线：以2-氟-4-溴-硝基苯（6）为起始反应物，通过亲核取代反应将双甲氨乙氧基侧链加上去生成硝基苯衍生物（7），还原此中间产物生成芳氨化合物（8），再在DIEA存在的条件下将8与DMF和HATU联合试剂反应生成溴化衍生物（9），最后在碳酸钾存在的情况下，以Pd[P(Ph)3]4为催化剂进行Suzuki偶合反应生成5，同样地，2、3、4也是用类似的方法合成。 结合五个化合物的合成路线，回顾从1到5的优化过程，作者始终遵循着先导物优化的三大原则：一、最小修饰原则——从1到2是用苯环取代了噻唑环，从2到3是用吡唑环取代了吡啶环，从3到4是在苯环上引入了甲氧基，从4到5是用双甲