天然DNA的制备.pptVIP

基因工程（Genetic Engineering） 田长恩 Tel:2.1 核酸与克隆有关的重要结构与性质 2.1.1 DNA的组成、结构、复制 和重要特性 2.1.1.1 DNA(RNA)的组成 双螺旋构象 茎环与发夹 tRNA二级结构 ——三叶草 tRNA三级结构 rRNA 核糖体 DNA超螺旋 核小体 核小体 mRNA功能（遗传密码) 密码子——简并 通用 连续 线粒体密码子 tRNA功能——转运氨基酸 遗传信息的传递与表达 2.1.2.2 真核生物基因的结构 1 名词解释 DNA变性；DNA复性；Tm值 2 简要回答下列问题 1） 举例说明浓缩DNA或RNA的方法。 2） 简述DNA与基因工程有关的主要特性。 3） 简要说明天然DNA的主要提取过程。 2.3 DNA的纯化 1）氯化铯－溴化乙锭连续梯度离心法 纯化剂量大、纯度高的DNA，须有超速离心机、氯化铯（昂贵），时间长。操作步骤如下： ① DNA 样品预处理：DNA溶液置离心管，每毫升加1g固体氯化铯， 30℃下缓慢溶解，再加溴化乙锭（EtBr或EB）溶液（ 10 mg／ml）至终浓度 0.7 mg／ml。溶液中氯化铯终浓度为 1.55 g／ml，折射率为 1.3860。 ②超离心：室温下8000 r／min离心5 min，吸取液面浮渣下的清液置于一塑料离心管中，用液体石蜡盖在液面上， 20℃下以45000 r/min 离心36－40 h。 ③收集DNA：紫外灯下观察DNA带。在DNA带下方用21号针头刺穿离心管壁收集DNA。 ④除EB：在收集液中加等体积正丁醇（水饱和），混匀，离心 (1500 r／min) 3 min，取水相。如此处理 4~6次，直至水相液体在紫外灯下无橘红色。 ⑤除氯化铯: 透析法。 2) 离子交换层析法 　　原理：DNA磷酸基团与固相材料上的离子相互作用，结合于层析柱固体介质，用浓度梯度盐溶液可将结合的离子洗脱。 　①三烃甲基氯化铵层析树脂法: DNA在低盐浓度（0.1~ 0.5 mmol／L NaCl）下与树脂结合，且双链 会比单链 结合牢，分子大的比小的结合牢，线形比环状分子结合牢。因此，当层析柱平衡后，可用 0.5~2.0 mmol／L的梯度浓度NaCl溶液洗脱DNA，分部收集洗脱液，经核酸紫外检测仪 检测，确定含有待纯化DNA的洗脱液，再经透析除去NaCl，获得纯的DNA。 ②羟基磷灰石法：低盐浓度溶液中，DNA和RNA的磷酸基团通过与羟基磷灰石的钙离子相互作用而结合，随后用浓度梯度磷酸盐溶液洗脱和回收DNA或RNA。单链DNA(或RNA)的磷酸基团比双链少，结合的牢固度低于双链，洗脱时先被洗脱。于是，可分部洗脱单链DNA（或RNA）和双链DNA。用核酸紫外检测仪确定待纯化 DNA的洗脱液，再经透析除去磷酸盐。 　　3) 琼脂糖凝胶电泳洗脱法 此法适用于小剂量DNA的纯化和酶切DNA片段的回收。 DNA样品 电泳 切胶 装(透析)袋或框 加稀释电泳缓冲液(1/10 ~ l/2), 稀释缓冲液电泳 1~2 h 反向电泳30~60 Sec 洗脱液置离心管 离心 转上清入新管 乙醇沉淀 离心 晾干 溶于TE （TE: 10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；1 mmol/L EDTA）。 4) 从DNA样品中去掉EB 经凝胶电泳回收和氯化铯浓度梯度高心制备的DNA样品，含有EB，影响酶切，因此，须去掉插入DNA中的EB。 可以用正丁醇（或异戊醇）抽提等方法。 正丁醇（或异戊醇）抽提法：加等体积正丁醇(用溶解 DNA的缓冲液饱和)入DNA样品溶液，轻轻混合，待上下相液体分开后，弃去上相正丁醇。重复以上步骤至少一次，至上相正丁醇无桔红色。 2.4　DNA(RNA)的浓缩 ①乙醇沉淀法：在样品中加1/10 体积的NaAc、2倍体积的无水乙醇，冰上10 min 以上，4 ℃下离心(12 000 g)10 min，去上清，70% 乙醇（4 ℃）洗涤，去乙醇，干燥后溶入TE，－20℃ (RNA于