黄瓜枯萎病菌遗传多样性的AFLP分析.pptVIP

与番茄枯萎病抗病基因I-1连锁 的AFLP和SSR分子标记 摘要 :本研究以番茄枯萎病抗病品种‘05045’与感病品种‘051451’为亲本配制杂交组合。用870对AFLP引物及319对SSR引物对348个 F2代分离群体进行连锁分析，得到4个与番茄枯萎病抗病基因I-1连锁的AFLP标记和 2个SSR标记，分别是E41M6O -D、E41M62 -C、E86M36-B、E32M44-E和SSR108、SSR276、与抗病基因 I-1的连锁遗传距离分别为4.7、 5.3、8.9、11.5cm和6.1、9.3cm。 番茄枯萎病是番茄生产特别是保护地栽培的重 要病害之一，是番茄生产中一个重要的限制性因素。 由于枯萎病是土传性病害，其病菌抗逆性强，药剂防 治效果不理想。因此，选育和利用抗病品种是番茄 枯萎病的主要防治方法。 早在1940年，人们就发现番茄枯萎病病菌有生理小种分化，并存在2个生理小种。枯萎病是由显性单基因控制 。通过F．0．lycopersici和栽培 番茄的相互作用，目前已发现有3个不同的抗病基 因，分别为I-1、I- 2、I- 3。 抗生理小种1的基因为 I-1；抗生理小种2的基因为I-2；对生理小种1和生 理小种2都具有抗性的基因为I- 3。目前，对I- 2、I-3基因的研究较深入，I- 2已进行到克隆阶段,I-3基因已RFLP 、AFLP 、SCAR、CAPS。等技术精确作图。但对I-1基因的研究不 够深人，Bohn，Paddock把I-1基因定位到第 11条染色体上，而Sarfatti把I-1基因定位到第7 条染色体上。 在分子标记技术中，AFLP技术和SSR技术被 广泛应用于基因的分子标记、定位、遗传图谱构建等方面。与其他技术相比AFLP技术多态性丰富、DNA用量少检测效率高、不受环境影响、无复等位 效应、带纹丰富、无需预知基因组的序列信息；SSR 技术多态性高、重复性好、具有共显性、操作简单。本研究利用AFLP技术和SSR技术，筛选与番茄枯 萎病抗病基因I-1连锁的AFLP标记和SSR标记，为加快番茄抗枯萎病育种、丰富番茄遗传图谱和番 茄分子标记辅助育种提供帮助。 试验材料 1．番茄材料 本试验以抗枯萎病品种‘05045’(含I-1基因) 为母本，感病品种‘051451’为父本，配制杂交组获得F1代，通过在海南岛加代获得F2 代。 2. 番茄枯萎病菌 番茄枯萎病菌属生理小种1 3. 试剂 试验所用的AFLP接头、AFLP引物、SSR引物 均由上海生工生物工程公司合成，RNase、Taq聚合 酶、MseI、EcoRI、T4连接酶均为美国MBI公司产 品，dNTP为TaKaRa公司产品，其他试剂均为国产 分析纯。 试验方法 1．番茄枯萎病抗性鉴定 把在PSA培养基上培养了7 d的番茄枯萎病病菌制备成分生孢子含量为10 7个／mL的菌悬液，采用浸根法结合注射法，在F 2代群体1～2片真叶时接种，遮光处理1周，25 d后调查并记录发病情况将F2代群体分为抗病和感病两类。 2. 叶片总DNA的提取 在发病高峰期分别取抗病和感病各20株幼嫩叶片，采用改良的CTAB法提取叶片DNA，用于构建抗感池。再取各F 2单株幼嫩叶片，提取DNA用于选择性扩增。用0.8的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA质量和浓度。 3. AFI P标记 AFLP标记参照Vos的方法。酶切采EcoR1／Mse I双酶切；预扩增引物采用E00和 M00；选择性扩增采用E引物和M引物组合的870 对引物。PCR产物用6 ％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 检测，80W恒功率电泳2h，银染后观察。 4. SSR标记 SSR标记参照优化的SSR体系 。采用319 对引物。PCR产物用6 ％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 检测，75w恒功率电泳1h，银染后观察。 5. 数据统计及连锁距离分析 利用x2检验分析AFLP、SSR多态性标记与抗 病和感病植株的性状分离情况。应用Map Maker 3．0软件计算连锁遗传距离，临界LOD值取3.0。 结果与分析 1. 抗病性鉴定结果 对F 2代群体的348个单株进行了番茄枯萎 抗病性鉴定，其中抗病259株，感病89株。x2=0.113，符合显性单基因的遗传规律。 2.AFLP标记 引物筛选 用父母本‘051451’和‘05045’对870对选择性 扩增引物进行筛选。筛出差异引物392对，筛出差异性较好的引物51对。在抗感池中对筛选