植物蛋白酶提取纯化工艺.docVIP

植物蛋白酶提取纯化工艺 生物工程09-2班 陈福泉 学号：3090343214 实验目的 了解植物蛋白酶常用的提取纯化方法的基本原理和基本操作； 掌握双水相和反胶束萃取的原理和操作步骤； 掌握蛋白质含量和蛋白酶酶活的检测方法 实验原理 植物蛋白酶常用的提取纯化方法有缓冲盐溶液提取、初步纯化的方法有有机溶剂法、乙醇粉法、丙酮粉法、盐析法、双水相法、反胶束萃取法等 以pH6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为提取溶剂所得酶活力较高，最佳工艺为：以pH6.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液25℃提取2次，料液比1∶1；应用硫酸铵盐析及透析袋透析对粗酶液进行纯化，粗酶液再以60%硫酸铵盐析24h，透析袋（14000）低温透析12h，冻干；酶学性质研究表明：生姜蛋白酶以酪蛋白为底物其最适pH值为6.0，30℃保温30min，酶活稳定。 实验材料 材料与试剂 新鲜生姜、酪蛋白（化学纯）、考马斯亮蓝G-250、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸、硫酸铵、丙酮等试剂均为分析纯。 0.01%（w/v）考马斯亮蓝G-250溶液：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 90%vol乙醇中，加入85%正磷酸100mL，蒸馏水定容至1000mL。 0.5%酪蛋白溶液：称取0.5g酪蛋白，先用少量0.55mol/L碳酸钠溶液润湿，再加少量0.02 mol/L pH7.5的磷酸缓冲液稀释，水浴中煮沸溶解，定容至100mL。 实验步骤 方法一：生姜蛋白酶提取液制备: 取定量新鲜生姜,切成小块后加入10 倍体积的pH 6. 0, 0. 2 mol/ L 磷酸缓冲液( 4 e ) , 于粉碎机中匀桨, 8 层纱布过滤后于4000 rpm 离心10 min, 吸取上清液, 加入高饱和度的( NH4) 2SO4 液使盐析体系中( NH4) 2SO4 终饱和度为60% , 4000 rpm 离心15 min。收集上层不溶物, 用少量pH 7. 50 的柠檬酸缓冲液溶解, 在4 e 下对同种缓冲液透析8 h。透析液定容, 即为生姜蛋白酶提取液。 方法二：生姜蛋白酶的提取 取外形完好、无机械损伤和腐烂、富含纤维的生姜，切成小块，与磷酸缓冲液（0.03mol/L，pH7.5，内含1 mmol/L EDTA和5mmol/L L-半胱氨酸）按料液比1：2打浆，所得浆液低速搅拌20m i n，搅拌过程中缓慢加入20％（m/v）固体硫酸铵，四层纱布过滤后，将姜汁4℃下静置2h，离心（4 800rpm，5min）去除沉淀，上清液用1.5倍的无水乙醇进行沉淀，再次离心去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。 生姜蛋白酶的反胶束萃取：在生姜蛋白酶提取液加入等体积的AOT-异辛烷阴离子反胶束或CTAB-庚烷/ 辛醇阳离子反胶束, 用磁力搅拌器以200 rpm 的速度进行搅拌5~10 min, 8000 rpm 离心10 min, 萃余液( 下层) 用考马斯亮兰法测定残留生姜蛋白酶酶活力和蛋白质量。 生姜蛋白酶的pI= 5. 4~ 5. 5, 在pH 5. 4 以上, 用AOT-异辛烷反胶束不能萃取出生姜蛋白酶, 但是却可以萃取出71. 86% 的杂蛋白。用CTAB 庚烷/ 辛醇反胶束二次萃取AOT-异辛烷萃余液, 其蛋白质萃取率为60125%。 双水相萃取 将不同分子量的聚乙二醇和成相盐按质量比配制一系列不同浓度及p H的双水相体系，每个双水相体系改变一个参数。由于备用溶液黏度很高，为减少误差，各组分含量均以质量分数（w）表示。加入一定量的聚乙二醇和下相盐后用去离子水调系统总质量至20g。充分溶解后倒入60m l的分液漏斗中进行分相，待分相完成后加入3m l的生姜蛋白酶粗酶液。将分液漏斗封口，反复倒置2～3m i n，每分钟10～15次，将体系各组分充分混合均匀后，室温下静置分相2h，使体系上下相分离完全。 资料表明，P E G-缓冲盐双水相萃取生姜蛋白酶的最佳萃取条件为：P E G分子量为4000，P E G浓度为20％，磷酸缓冲液的p H值为6.5，浓度为10％，生姜蛋白酶上相酶活力回收R和纯化倍数P F可达279.05％和1.86 生姜蛋白酶活力测定 绘制标准曲线 配制各取6 支刻度试管, 分别加入0. 4、0. 8、1.2、1. 6、2. 0、2. 4μg 牛血清白蛋白2 滴1:1 HCl,及3 mL 考马斯亮兰G-250 液, 室温下显色30 min后用蒸馏水定容至10 mL, 于595 nm 下测定OD595。以蛋白质质量为横坐标, OD595 为纵坐标绘制标准曲线。其线性回归方程为: Y= 01019X- 0. 001。 蛋白质浓度测定 取定量蛋白溶液, 加入pH= 6. 0 的磷酸缓冲液3 mL, 3 mL 考马斯亮兰G-250 液及2 滴1:1 HCl,室