纤维素酶活力的测定方法.docVIP

纤维素酶活力的测定方法 1?原理 ?纤维素酶是一种复合酶。酶系包括外切B-1.4-葡聚糖酶（ExoB-1.4glucanase,EC3.2.1.9）内切B-1.4葡聚糖酶（Endoβ-1.4-glucanase,EC1.2.1.4）和纤维二糖酶。纤维素酶在一定温度和PH条件下，将纤维素酶底物（滤纸或羟甲基纤维素钠）水解，释放出还原糖。在碱性，煮沸条件下，3.5-二硝基水杨酸（DNS试剂）与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖（与葡萄糖汁）含量成正比。通过在540nm测定吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的FPA酶和CMCA酶活力，以此代表纤维素酶的酶活力。 2?操作 ???A.FPA酶 ??A.1绘制标准曲线 ??按表1规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液、缓冲溶液和DNS试剂加入各管中，混匀。 ??表1葡萄糖标准曲线 ????????管号?????葡萄糖标准使用溶液??缓冲液吸取量?DNS试剂吸取量ml????????浓度mg/ml???吸取量ml??0??????????0.0???????0.00???????2.0???????????3.01?????????1.0???????0.50牋牋牋?.5牋牋牋牋牋?.02牋牋牋牋?.5牋牋牋?.50牋牋牋?.5牋牋牋牋牋?.03牋牋牋牋?.0牋牋牋?.50牋牋牋?.5牋牋牋牋牋牋3.04牋牋牋牋?.5牋牋牋?.50牋牋牋?.5牋牋牋牋牋牋3.05牋牋牋牋?.0牋牋牋?.50牋牋牋?.5牋牋牋牋牋?.06牋牋牋牋?.5牋牋牋?.50牋牋牋?.5牋牋牋牋牋?.0 牋将标准管同时置于沸水浴中，反应10min。取出，迅速冷却至室温。用水定容至25ml，盖塞，混匀。用10mm比色杯，在分光光度计波长540nm处测量吸光度。以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。线性回归系数应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。 A.2?样品的测定 A.2.1待测酶液的制备 称取固体酶样1g，精确至0.1mg（或吸取液体酶样1ml,精确至0.01ml），用水溶解，磁力搅拌混匀，准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.3-0.4范围内），放置10min，待测。 A.2.2?滤纸条的准备 ?----将待用滤纸放入（硅胶）干燥器中平衡24h----将水分平衡后的滤纸制成宽1cm、质量为（50±0.5）mg的滤纸条，折成M型，备用。 A.3?操作程序 ----取四支25ml刻度具塞试管（一支空白管，三支样品管）。将折成M型的滤纸条，分别放入每支试管的底部（沿1cm方向竖直放入）。----分别向四支试管中，准确加入相应PH的缓冲溶液1.50ml.----分别准确加入稀释好的待测酶液0.50ml于三支样品管中（空白管不加），使管内溶液浸没滤纸，盖塞。----将四支试管同时置于（50±0.1）℃水浴中，准确计时，反应60min，取出。----立即准确地向各试管中加入DNS试剂3.0ml。再于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.50ml，摇匀。将四支试管同时放入沸水浴中，加热10min，取出，迅速冷却至室温，加水定容至25ml，摇匀。----以空白管（对照液）调仪器零点。分光光度计波长540nm下，用10nm比色杯，分别测量三支平行管中样液的吸光度，取平均值。以吸光度平均值查标准曲线或线性回归方程求出还原糖含量。 A.4?计算 A.4.1?滤纸酶活定义?????????????????????????????? 1g固体酶（或1ml液体酶）在（50±0.1）℃、指定pH条件下（酸性纤维素酶pH4.8，中性纤维素酶pH6.0),1h水解滤纸底物，产生出相当于1mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g（或u/ml）表示。????????????????????????????????? ?A.4.2FPA酶活力按式（表.1）计算。??????????????????????????????????????????X1?=A×1/0.5×n ????????????????????????????式中： ??????????????????????????????X1----样品的滤纸酶活力（FPA）,u/g(或u/ml);A----根据吸光度在标准曲线上查的（或计算出）的还原糖量。mg;1/0.5----换算成酶液1mln----酶样的稀释倍数。允许差：同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的10%。变异系数不超过10% B.