绿茶SOD的提取与分离.docVIP

绿茶细胞SOD的提取与分离 一 原理 超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子（O-2）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O-2+H2=O2+H2O2 。绿茶叶片细胞中有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用PH7.8的磷酸缓冲液提取。由于不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。 二 材料和试剂 （1）新鲜绿茶叶片 （2）磷酸缓冲液：0.05mol/L，PH7.8的磷酸缓冲液。 （3）氯仿—乙醇混合溶剂：氯仿：无水乙醇=3:5（v/v）. （4）丙酮：用前冷却至4~10℃。碳酸盐缓冲液：0.05mol/L，PH10.2. EDTA溶液：0.1mol/L。 肾上腺素液：2mol/L。 2．主要仪器: （1）可见分光光度计 （2）万分之一分析天平 （3）离心机（4）冰箱 （5）光照箱：4 500Lux （6）带盖瓷盘 1个/处理 （7）移液管架 （8）研钵 （9）离心管 5mL数个 （10）微烧杯 10～15mL 8个/处理（11）移液管或加样器 0.5mL×4；1mL×2；2mL×2；5mL×1 （12）微量进样器 50μL×2；100μL×2 （13）烧杯 50mL×3；100mL×5；500mL×1；1 000mL×2 （14）量筒 50mL×1；100mL×2 (15）容量瓶 50mL×1；100mL×5；250mL×1；1 000mL×2 （16）细口瓶 125mL×5 三 操作方法 1 组织或细胞破碎 称取5g左右绿茶新鲜叶片，置于研磨器中研磨，使组织或细胞破碎。2 2 SOD的提取 将上述破碎组织或细胞，、加入2~3倍体积的0.05mol/L，PH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后用离心机在5000 r/min下，离心15min，弃沉淀，得提取液。 3 除杂蛋白 提取液加入0.25倍体积的氯仿—乙醇混合溶剂搅拌15min，5000r/min,离心15min，去杂蛋白沉淀，的粗酶液。 4 SOD的沉淀分离 将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000 r/min离心15min，得沉淀SOD。 将沉淀溶于0.05mol/L，PH7.8的磷酸缓冲液中，于55~60℃热处理15min，离心弃沉淀，得到SOD酶液。 5 SOD活力测定 取3根小试管，按下表分别加进各种试剂和样品液。 （ml） 试剂 空白管 对照管 样品管 磷酸缓冲液 5.0 5.0 5.0 EDTA溶液 0.5 0.5 0.5 蒸馏水 0.5 0.5 — 样品液 — — 0.5 混 合 均 匀 肾上腺素液 — 0.5 0.5 在加入肾上腺素前，充分摇匀并在30℃水浴中预热5min至恒温。加入肾上腺素（空白管不加），继续保温反应2min,然后立即测定各管在480nm处的光密度。对照管于样品管的光密度值分别为A和B。 在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化的50%所需要的酶量定义为一个酶活力单位。 即： 酶活力（单位）=(2*（A-B）*N)/A 式中 N——样品稀释倍数 2——抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数（100%/50%）。 若以每毫升样品液的单位数表示，则按一下计算 酶活力单位/ml={[2*（A-B）*N]/A}*(V/V1)=[26*(A-B)*N]/A 式中V——反应液体积（6.5ml） V1——样品液体积（0.5ml） 最后，根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化器收率。