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狂犬病病毒培养技术的研究进展 狂犬病作为一种几乎100%致死的人兽共患传染病，对人类的危害已经存在了4000多年，至今仍无有效的治疗药物，可行的控制策略只有暴露前免疫和暴露后预防。其中暴露前免疫主要是针对动物而言，因为人的狂犬病来源于动物，只要动物的狂犬病免疫预防有效，可完全控制人狂犬病的发生；而暴露后预防主要用于人，因为人一旦被带毒动物咬伤，必须及时进行全程的暴露后预防才能防止感染狂犬病病毒。 不论是暴露前免疫，还是暴露后预防，都离不开安全、有效、廉价的疫苗。人和兽用狂犬病疫苗的发展，都依赖于病毒培养技术的不断进步，尤其是微载体、发酵技术和无血清培养基的广泛应用，把狂犬病病毒的增殖滴度提高到了一个新的水平，同时降低了生产成本，从而使高质量的细胞纯化疫苗逐渐占领市场。 无论是传统的体内培养技术，还是现在的细胞培养技术，以及新型的细胞发酵和生物反应器，目前都广泛应用于狂犬病病毒的实验室研究或疫苗生产。本文主要就狂犬病病毒培养技术的发展和新技术的应用现状综述如下。 1 体内培养技术 体内培养技术利用了狂犬病病毒的嗜神经特性，具有敏感性好的优点，可以提高病毒检测的阳性率，而且易于操作，适用于不具备组织培养条件的实验室。其中，小鼠脑内接种是实验室最常用的狂犬病诊断和病毒培养技术之一，其他动物如大鼠、羊、兔等，过去主要用于狂犬病神经组织疫苗的生产。 禽胚胎培养技术主要是利用鸭胚和鸡胚进行狂犬病病毒培养，如鸡胚传代致弱的Flury-HEP、Flury-LEP和Kelev毒株。 1.1 脑内培养技术 小鼠脑内接种是最常用的狂犬病病毒脑内培养技术，最早用于狂犬病野毒株的分离培养是在1925年[5]。1955年，Fuenjalida和Palacios新生鼠脑制备疫苗（SMBV）该疫苗南美洲使用40多年州diploid cell, HDC）疫苗是最早商品化的细胞培养疫苗，目前已在世界范围内得到广泛应用，并成为其他狂犬病细胞培养疫苗的参照标准。法国Marcy l′Etoile的Merieux研究所和德国Marburg的 Behring研究所研制的人二倍体细胞疫苗均以人二倍体细胞MRC-5培养，经β-丙内酯（BPL）灭活后制得。两者不同的是，Behring研究所生产的疫苗经梯度超速离心进行浓缩和纯化，而Merieux研究所系通过超滤实现疫苗的浓缩。 人用纯化鸡胚细胞疫苗(PCEC)是以原代SPF鸡胚细胞培养制备的，该疫苗为冻干品，其制备过程主要包括β-丙内酯灭活后狂犬病病毒抗原的纯化和浓缩等。 早期对组织培养的研究发现，经鸡胚细胞培养的低代狂犬病病毒Flury株(low egg passage Flury strain, Flury-LEP)更适于作为疫苗株使用。在此基础上，1973年以Flury-LEP株研制出兽用灭活疫苗。以此系统进行人用鸡胚细胞疫苗的生产，首先须将收获的狂犬病病毒经蔗糖密度梯度离心，达到浓缩、纯化的目的。改良后的抗体结合试验可以用于灭活后狂犬病病毒抗原成分的定量。20世纪80年代，建立了多种适用于纯化鸡胚细胞疫苗的实验室检测方法，并开始了在人的临床试验。 恒河猴胎猴肺二倍体细胞（FRhMDC）疫苗是由美国的公共卫生部的密歇根州生物制品研究所在20世纪70年代开发的。1979年开始在志愿者中进行临床试验， 1988由美国食品与药物管理局（FDA）批准用于暴露前后狂犬病防治。 人用狂犬病犬肾细胞疫苗是利用犬肾细胞在微载体上培养的。疫苗的冻干品包括经?-丙内酯灭活的狂犬病病毒固定毒株和用以吸附病毒的磷酸铝佐剂。 建立了敏感的细胞系和细胞株以后，可以系统研究狂犬病病毒及病毒与宿主细胞的相互作用。迄今已有很多传代细胞系用于动物狂犬病疫苗的制备，如BHK-21、仓鼠肾成纤维细胞（Nil-2）和鸡胚相关细胞（CER）。但由于某些细胞系的异源特性和潜在致瘤性，目前只有猴肾细胞Vero用于人狂犬病疫苗的制备。 人二倍体细胞（WI-38）在1964年首次报道用于人狂犬病疫苗生产，此后，其他二倍体细胞如人胚肺细胞（HEL）、人肺细胞（MRC-5）和恒河猴二倍体细胞系也用于人狂犬病疫苗生产。 除了上面提到的细胞以外，狂犬病病毒还可在胚胎鸡肌管、鼠的巨噬细胞、大鼠感觉神经系统、大鼠垂体肿瘤细胞、黑山羊和豚鼠肾细胞、胎儿蝙蝠细胞、人滑液（McCoy）细胞、日本鹌鹑胚胎细胞和中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中复制。病毒接种昆虫细胞也能检测到病毒特异性抗原，但其水平明显低于其他细胞。 人和小鼠源的成神经细胞瘤细胞已广泛用于狂犬病病毒研究，尤其是鼠成神经细胞瘤细胞（NA-C1300，为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷细胞株），显微镜下观察，该细胞与人的神经元大致相同，细微结构都有神经元样形态，在微管蛋白、神经递质合成酶和可兴奋细胞膜上也有很多共同特征。 狂犬病病毒固定