探讨过度的糖基化终末产物的堆积对血管的损害.docVIP

探讨过度的糖基化终末产物的堆积对血管的损害 实验目的： 此实验采用免疫组织化学法检测AGEs在血管壁的分布情况，研究糖尿病动脉粥样硬化血管壁糖化的程度。探讨过度的糖基化终末产物的堆积对血管的损害。 （AGEs是在非酶促条件下，蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等大分子物质的游离氨基与还原糖的醛基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰后产生一组稳定的棕黄色的终末产物。） 技术路线： 1.切片选择：石蜡切片制备程序（取材，固定，脱水，浸透， 石蜡包埋，切片及贴片） A组（对照组）：非糖尿病者无动脉粥样硬化动脉血管石蜡切片， B组（实验组）：糖尿病者动脉粥样硬化动脉血管石蜡切片 2.抗体选择： 一抗兔抗人抗体； 二抗碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体 3.免疫组织ABC法操作程序 （1）烤片 温度和时间为58~60℃,2~3小时。 (2) 脱蜡和水化 切片在染色缸中分别在二甲苯Ⅰ和Ⅱ中浸泡15~30分钟，依次经过下行梯度乙醇至水。在无水乙醇Ⅰ、Ⅱ中分别浸泡5分钟，95%、90%、80%及70%乙醇中分别浸泡2分钟，PBS漂洗3分钟×3次，放置蒸馏水中待用。 （3） 抗原修复 水浴加热法：将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续10～15分钟。 （4） 细胞膜打孔 切片置于0.3%Triton X-100中室温浸泡25分钟，PBS漂洗3分钟×3次 （5）灭活内源性过氧化物酶 左旋咪唑加入底物液中并保持pH为7.6-8.2，可除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶可用0.05mol/L酒石酸抑制。 （6）正常血清封闭液:羊血清20 ul，室温孵育15分钟，甩去多余液体，不洗。 （7）滴加一抗（用PBS稀释为工作浓度）20 ul 37℃2小时，PBS洗3分钟，洗涤3次。 (8）滴加二抗20 ul 37℃20分钟，PBS洗3分钟，洗涤3次。 (9)滴加SABC液20ul,37℃孵育20分钟，PBS洗3分钟（3次）。 (10)室温NBT`显色，镜下控制显色程度，显色后蒸馏水或自来水冲洗，染色过程中缓冲液用0.02mol/L TBS（pH8.2）。 （11）苏木精复染5-10秒，自来水反蓝，上行梯度乙醇脱水分别2分钟，透明用二甲苯Ⅰ和Ⅱ各10分钟，树脂封片后镜下观察。 4.显示碱性磷酸酶的方法：可通过靛蓝四唑反应显色，靛蓝四唑反应底物为溴氯羟吲哚磷酸盐（BCIP）经酶水解并氧化形成靛蓝，二硝基蓝四唑（NBT）在氧化过程中被还原成不溶性紫蓝色沉淀。 ①钙-祜法：在碱性环境（PH9.2~9.4）中，碱性磷酸酶奖磷酸盐的底物分解，产生的磷酸离子被孵育液中的钙离子捕获生成磷酸钙沉淀，因磷酸钙不显色，需要加入硝酸祜，用祜离子置换钙离子，形成磷酸祜沉淀后有硫化氨处理，形成棕黑色硫化祜沉淀，从而显示酶活性部位，硫化祜沉淀的多少鱼碱性磷酸酶含量成正比。 ②偶氮-偶联法：人工合成的磷酸萘酚盐经碱性磷酸酶水解后释放出萘酚，后者立即与重氮盐偶联生成不溶性偶氮色素。 5.结果保存与分析： 图像分析的两种方法： 1.人工分析：人工计数；着色强度分析。 2. 显微图像分析系统:计算机能自动精细处理各种有形的标本图像，它不仅能通过各种成像系统获得图像的几何数据、光密度、灰度等信息，还可运用该系统对获得的信息作进一步处理。 AGEs表达采用半定量分析，即随机选取10个连续不重复的视野(x200)，根据血管壁着色情况计算阳性指数(PI)：阳性信号面积X阳性强度，求和、取平均数。形态学分析用盲法以减少误差。阳性面积与阳性强度计算方法如下：(1)阳性面积，阴性无着色0分，25％着色1分，25％～50％着色2分，51％～75％着色3分，75％着色4分；(2)阳性强度，阴性无着色0分，弱阳性1分，中等阳性2分，强阳性3分。 糖尿病粥样硬化血管横截面的组织切片上，内膜及内膜下层AGES呈蓝黑色，强阳性反应，而中膜AGEs的阳性反应且分布比较均匀，呈条索状。而非糖尿病者无动脉硬化，血管横截面的组织切片上，内膜、内膜下层及中膜AGEs呈阴性反应。非糖尿病动脉硬化血管横截面的组织切片上，内膜及内膜下层AGES呈阳性反应，中膜AGES的阳性反应分布均匀，亦呈条索状 6.实验讨论： 目前已经发现多种 AGEs 与动脉粥样硬化的发生和发展均有密切的关系。AGEs 可刺激内皮细胞增加诱导型一氧化氮合酶 mRNA 表达，诱导内皮细胞凋亡，促进细胞外基质、促凝血因子、组织因子及血小板与平滑肌细胞接触，引起单核-巨噬细胞迁移，吞噬脂质，启动动脉粥样硬化的病理过程，促进早期动脉粥样硬化斑块形成。 糖基化终末产物是还原糖与蛋白质、氨基酸等的游离氨基通过一系列复杂的非酶促反应形成的结构多样的不可逆聚合物。AGEs与血管内皮细胞上AGEs受体结合后使血管壁通透性增加而不破坏其完整性导