农杆菌介导棉花遗传转化体系的优化.pdfVIP

农杆菌介导棉花遗传转化体系的优化1 赵常燕，王省芬，韩改英，马峙英∗ 河北农业大学/ 河北省作物种质资源重点实验室，河北保定（071001 ） E-mail ：mzhy@ 摘 要：本文采用正交设计方法，研究了农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化过程中菌液浓度、 侵染时间、共培养时间和共培养温度对抗性愈伤转化效率的影响。结果表明，4 个因素均对 抗性愈伤的诱导率有极显著影响，其诱导效应依次是共培养温度菌液OD 值侵染时间共 培养时间。按照正交设计的原则，最终得到农杆菌介导转化棉花下胚轴的最佳条件是：菌液 OD 值为0.3 ，侵染15 min，24 ℃共培养24 h ，下胚轴抗性愈伤的转化效率最高。用珂312、 中521 和农大94-7 对所选出的最佳组合进行验证的结果表明：优选组合下抗性愈伤组织的 诱导率很高，分别为93.85%、86.72%和85.83%。 关键词：棉花；农杆菌介导；正交设计；抗性愈伤 中图分类号：S562.032 1. 引言 在棉花遗传转化中，目前应用最多的转化方法是农杆菌介导法。虽然农杆菌介导法具有 基因型依赖性，转化周期长，再生苗畸形率高等缺点，但其转化效率较高，容易获得纯合的 转化株系，外源基因整合拷贝数低，能够转移较大的 DNA 片段。自 1987 年 Umbeck 和 Firoozababy 等分别以下胚轴和子叶为受体，利用农杆菌介导法获得转化植株以来，该方法 在棉花遗传转化中得到了迅速应用。目前，已成功地将抗虫基因[1-3]、豇豆胰蛋白酶抑制剂 [4] [5] [6] 基因（CPTI） 、慈菇胰蛋白酶抑制剂基因（API ） 、葡萄糖氧化酶基因 、豌豆凝集素基 因[7]分别转化到棉花中，获得了抗性强且遗传稳定的转基因植株。在这些报道中，虽然菌液 浓度、侵染时间、共培养时间和共培养温度均有涉及，但研究者均没有对之开展系统研究。 [8] [9] 孟颢光 、亓建飞 等仅对菌液浓度和侵染时间进行了研究，并且抗性愈伤的转化效率不高。 本研究旨在利用正交设计方法，对影响农杆菌介导的棉花遗传转化的 4 个主要因素进行系统 和综合研究，优化遗传转化体系，提高遗传转化效率，研究结果对于深入开展棉花转基因育 种具有重要意义。 2. 材料和方法 2.1 试验材料 供试棉花品种为陆地棉冀无 2031 （优化转化体系的受体材料）、珂312、中 521 和农大 94-7 （验证试验结果最佳组合的受体材料）由河北农业大学棉花遗传育种研究室提供。所用 大肠杆菌菌株为 E. coli DH5α，携带质粒pC-KSA2300 ，质粒由南开大学生物技术研究室李 明刚教授构建提供，表达载体上含有根特异性表达启动子pyk 10 （图1）。所用根癌农杆菌 菌株为 EHA105 ，购自北京拜尔迪生物技术公司。 1本课题得到 863 计划（2006011001044 ）、河北省科技支撑计划重大项目 ）、河北省自然科学 基金重点项（C2006001034 ）等资助。 - 1 - 图 1 pC-KSA2300 质粒图谱 Fig.1 Map of plasmid pC-KSA2300 2.2 试验方法 2.2.1 无菌苗培养及下胚轴制备 种子经浓硫酸脱绒后晾干，用 0.1%升汞处理 8~10 min，无菌水冲洗 3~4 次后，浸泡于 无菌水中过夜至露白。将处理好的种子接种于无菌苗培养基上，(28±2) ℃暗培养使其萌发。 以7 日龄无菌苗的下胚轴为外植体，剪成0.5~1 cm 的切段用于转化。 2.2.2 农杆菌侵染液的制备 挑取农杆菌单菌落，接种于含有相应抗生素的 LB 液体培养基中，培养过夜。待菌株浓