一种快速、高效的橡胶树胶乳总RNA提取方法.pdfVIP

植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (4): 516520, .技术与方法. 一种快速、高效的橡胶树胶乳总R NA 提取方法 * 张治礼, 杨云, 刘宽灿, 苏火生 中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 热带作物生物技术国家重点实验室, 海口 57 110 1 摘要 胶乳是橡胶树(Hevea brasiliensis)乳管中特殊的细胞质, 主要由橡胶粒子、黄色体、F-W 粒子和普通细胞质成分构 成, 其中橡胶粒子占20%-40%, 蛋白含量高达1%-2%。由于高比例橡胶粒子和蛋白质的干扰, 目前使用的胶乳RNA提取方 法都具有步骤繁琐、胶乳需求量大、操作技巧性强不易掌握等缺点。为快速、高效地获取高质量的胶乳RNA, 我们在现有方 法的基础上摸索出一套步骤简单、容易操作、快速、高效提取橡胶树胶乳总RNA 的简易方法, 获得了较好的实验效果。紫外 分光光度计、RT-PCR和RACE分析结果表明, 使用该方法提取的胶乳RNA质量完全能够满足相应的分子操作, 但所需时间仅 为目前常用方法的50%, RNA获得率提高了2-3倍, 操作难度大大降低。 关键词 橡胶树, 胶乳, 方法 , RNA提取 张治礼, 杨云, 刘宽灿, 苏火生 (2007) . 一种快速、高效的橡胶树胶乳总RNA 提取方法. 植物学通报 24 , 5 16 520 . 橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳是橡胶树特有的细 了技术便利。 胞质, 除含有普通的细胞器成分外, 还含有橡胶粒子、 黄色体等特有细胞器, 其中蛋白质含量约为1%-2%(诸 1 材料与方法 杰和朱南康, 2006), 橡胶粒子含量高达20%-40% 。高 含量蛋白和橡胶粒子的干扰, 为有效提取高质量胶乳 1.1 材料 RNA 增加了难度。Kush等(1990)首次报道成功提取了 胶乳采自中国热带农业科学院试验场教学一队, 橡胶树 高质量的胶乳RNA, 同时提出了橡胶树胶乳收集的具体 (Hevea brasiliensis)无性系为热研7-33-97 。胶乳收集 方法, 目前使用的胶乳RNA提取方法大都是在该方法的 参照黄贵修等(2002)提供的方法进行。 基础上稍加改进而成。用Kush 等(1990)的方法提取胶 乳RNA , 从加入提取液到获得RNA 整个过程涉及13个 1.2 主要试剂 主要步骤, 至少需要14小时; 使用黄贵修等(2002)的方 T ris 、LiC l 、EDTA - Na2 、S DS 、水饱和酚、氯仿、 法, 也涉及10 个主要步骤, 至少需要3-4 小时。这2 种 异戊醇均购自上海生物工程公司, MMLV反转录试剂盒 方法是目前最常用的胶乳RNA提取方法, 都具有步骤烦 为MBI 产品, 其余常规试剂均为国产分析纯。 琐、用时长、操作技巧性强不易掌握等缺点。 一种高效、成熟的R NA 提取方法应具有操作简 1.3 RNA提取缓冲液配制 -1 便、用时少、获得率高和提取的R NA 质量好等特 . . 将10 mL 1 mol L Tris-HCl(pH 8.0)、3.75 mL 8 mol -1 -1 点。经过多次实验, 我们实验室发展了一种新的、高 . L LiCl、2 mL 0.5 mol L EDTA-Na 和50 mL 20%