人甲胎蛋白基因启动子siRNA表达载体的构建及效应鉴定.pdfVIP

· 19O · 肿瘤 2007年 3月第 27卷第3期 TumorVo1．27，No．3，March，2007 BasicResearch ·基础研究 人甲胎蛋白基因启动子 siRNA表达载体的构建及效应鉴定 王水 良，庄岳鹏 ，王志红，兰风华 (南京军区福州总医院检验医学研究所分子医学研究中心，福州 350025) [摘要] 目的：探索基于人甲胎蛋白基因启动子构建的siRNA表达载体介导 目的基因RNA干扰的可行性，为实现肝癌细胞 靶向RNAi治疗作一初步研究。方 法 ：PCR法扩增获得人 甲胎蛋 白基 因启动子并插入 pSilencer1．0-U6中以置换其 U6启动 子；依据 hLRH-1基 因RNAi靶位点设计 出siRNA模板 DNA，体外合成相应寡核苷酸片段后经退火形成短双链 ，再克隆构建 成靶向人 hLRH-1基因 siRNA表达载体 ；脂质体转染法将上述重组质粒转入 HepG2细胞 中，实时定量 PCR法初步分析所建 系统在AFP表达细胞中触发靶基因hLRH-1的RNAi效应，以及 hLRH-1调控下游靶基因的表达改变。结果 ：获得人 甲胎 蛋 白基因启动子驱动的siRNA表达载体 pSiAFP 所建的RNAi载体系统可在表达AFP的HepG2细胞中有效诱导靶基因 hLRH-1表达 下调 ，抑制率约达 85 ；同时调控hLRH一1下游靶基 因CyclinE1与Oct4的表达相应下调。结论 ：人 甲胎蛋 白 基因启动子驱动的siRNA表达载体可在表达AFP的HepG2细胞中有效介导靶基因的RNAi效应。 [关键词] 肝肿瘤，实验性；甲胎蛋 白类；RNA干扰；调控序列，核酸；HepG2细胞 [中图分类号] R735．7；R73—36 2 [文献标识码] A [文章编号] 1000—7431(2007)03—0190～04 ConstructionofsiRNA expressionvectordrivenbypromoterofhumanalpha-fetoproteingeneand theidentification of itsRNAieffcet W ANG Shui—liang，ZHUANG Yue—peng，W ANG Zhi—hong，LAN Feng—hua (CenterforM olecularMedicine，Institute ofLaboratoryMedicine，FuzhouGeneralHospital，Fuzhou350025，China) [ABSTRACT~ Objective：ToexplorethepossibilityofRNAinterferencemediatedbyhumanalpha—fetoproteingene(AFP)pro— moter-basedsiRNA expressionvector，thusofferapreliminarystudyforfulfillingthetargetofRNAitherapyforhepatocellular carcinoma．Methods：ThepromoterofhumanAFPgenewasamplifiedbypolymerasechainreaction (PCR)andinsertedintopSi— lencer1．0-U6toreplaceitsU6promoter．DNA templateofsiRNA targetinghumanhLRH一1wasdesignedaccordingtoaformer— lyselectedRNAisite．Aftersynthesizedinvitroandannealed，theformeddouble-strandedDNA templatewassubclonedtocon— structthesiRNA expressionvectortargetinghLRH—1．TherecombinantwasintroducedintoHepG2mediatedbyLipofectamine． Real—timereversetranscriptase (RT)一PCR wascarriedouttoanalyzetheRNAieffectonthetargethLRH geneinAFP—express— in