亲和层析纯化猪胰蛋白酶的研究.pdfVIP

维普资讯 第 l6卷第 3期 郑 州 牧 专 学 报 Vol16 No3 1996年 9月 JournalofZhengzhouCollegeofAnimalHusbandry Sep 1996 亲和层析纯化猪胰蛋 白酶的研究 孟 国 良 甚2 ．1 r (畜牧 I程系) A。 摘要 采用猪胰蛋白酶的天然抑制剂 一鸡卵类粘蛋 白(CHOM)作为配基合成亲和吸附剂，从猪胰脏 的粗提液 中，通过亲和层析直接获得高纯度的胰蛋 白酶。此法具有操作 简便、产品纯度、比活力和获 得率高等优 点= 关键词 墨坚墨旦堕：塑耋垫蛋自；量塑星虹；堕．．i巷 胰蛋 白酶是广泛应用于轻工业 、医药工业 、畜牧业和现代生物技术领域 的一种重要的 酶，用传统的方法从猪 、牛、羊等动物胰脏 中提取的胰蛋 白酶实际上是胰蛋 白酶、胰淀粉酶和 胰脂肪酶等的混合物 。通过亲和层析技术直接从猪胰脏粗提液 中获得的胰 蛋 白酶 ，其 比活 力达 18×104BAEE单位 ／mg酶蛋白，纯化率提高 l0倍 以上 ，相 当于 5次重结 晶的胰蛋 白 酶 ，可与进 口胰蛋 白酶相嫂美。 1 材料与方法 1．1 实验材料及主要仪器设备 鸡蛋、新鲜猪胰脏 、结 晶胰蛋 白酶 ；低速离心机 、水浴锅 、真空干燥器 、层析柱 、核酸蛋 白 质检测仪 、分光光度计 、布氏漏斗、摇床 玻璃漏斗、组织捣碎机 、冰箱等 12 实验方法及步骤 1．2．1 鸡 卵类粘 蛋 白的制备 1211 鸡卵类粘蛋 白粗品的制备 取蛋清 50ml，加入等体积 l0％的三氯醋酸 (PH115) 后 ，出现大量 白色沉淀 ，搅匀后室温静置 4h以上 ，待清蛋 白完全沉淀，300flrpm离心 10min， 弃沉淀，过滤上清，调pH至 35，冰浴片刘，缓缓加入 3倍体积 的预冷丙酮，搅匀后冰浴 4h 上 ，待鸡卵类粘蛋 白完全沉淀，将沉淀在 3000rpm 下离心 15min，弃上清 。沉涟物放置真 空干燥器内，抽气去丙酮，然后用 20ml蒸馏水溶解。层析柱脱盐 ；称取 30gSephadexG一25 于 002M pH6．5磷酸缓冲液 (5O0m1)中热溶胀 2h，脱气后装柱 (35×300rnm)，柱床体 积 150ml：然后用 2倍体积的 002M pH65磷酸缓冲液平衡，当流出液在核酸蛋 白质检测仪 上绘 出稳定的基线，或测其 OD2B0002，即可取 20ml鸡 卵类粘蛋 白粗提液上柱 (上柱量不 超过柱床体积的 1／6)，用 0．02mpH65磷酸缓冲液洗脱，收集第一峰，即鸡卵类粘蛋 白粗翩 液 。 收稿时间：l996一O6—21 维普资讯 l2 郑 州 牧 专 学 报 L996芷l 1．2 12 鸡 卯类粘蛋 白粗 制液 的纯化 称 取 DEAE 纤 维索 粉 10g，在 150ml、05M NaOH一0．5M Na2(1中浸泡 20min，在垫有 200目尼龙 网的布氏漏斗 中抽滤 ，蒸馏水洗 至 中 性 (pH8．0)，移至烧杯 中，在 150ml05M HC1中浸泡 20min，抽去水分，移至布 氏漏斗抽滤， 蒸馏水洗至 中性 (pH6．0)，移至烧杯 中、以 150ml002M PH65磷酸缓冲液 中浸泡片刻 ，真 空干燥 器 内脱气装往，以pH6．5磷酸缓冲液平衡至 OD2 002．或在核酸蛋 白质捡测仪 上绘出稳定的基线一用上述脱盐 的鸡 卵粪牯蛋 白粗制液上柱吸附，以 0．02M，pH6．5的磷 酸缓冲液洗 去杂蛋 白，流出液在检测仪上绘出稳定基线，然后用 03MNacI～002M D1-165 磷酸缓冲液洗 脱 ，收集等二峰。 12 1．3 透析 除盐及纯 品的制备 将上述收集液装入透析袋 内，对蒸馏